Voivatko ruokavalion fytoestrogeenit hidastaa eturauhaskasvainten leviämistä? (PRODICA)

Ekologisista ja kokeellisista tutkimuksista saadut tiedot osoittavat selvästi ravinnon kasviestrogeenien suojaavan eturauhassyöpää vastaan. Geneettisillä tekijöillä on myös eturauhassyövän etiologinen merkitys, ja geenien ja ruokavalion vuorovaikutuksen merkityksestä eturauhassyövän etenemisessä on yhä enemmän näyttöä. Tutkijat ovat äskettäin löytäneet oletetun geneettisen vuorovaikutuksen tälle fytoestrogeenien suojaavalle roolille. Estrogeenireseptori-beeta (ERß) -geenin nukleotidisekvenssivariantti muunsi voimakkaasti pienentynyttä eturauhassyövän riskiä miehillä, jotka nauttivat runsaasti kasviestrogeenia. Amerikkalainen tutkimus havaitsi samanlaisen vuorovaikutteisen vaikutuksen fytoestrogeenien saannin sekä kehon massaindeksin (BMI) ja toisen ERß:n nukleotidisekvenssimuunnelman välillä. Isoflavonoidit ja kumestaanit sitoutuvat tiukasti estrogeenireseptori-betaan (ERß) ja ovat pääasiassa löytyy soijasta ja muista papuista. ERß:n ilmentymisen on havaittu osallistuvan eturauhassyövän etenemiseen, mikä viittaa siihen, että fytoestrogeenit voivat olla vuorovaikutuksessa ERß:n kanssa eturauhassyövän kehittymisessä. Mitä tulee mahdollisiin karsinogeenisiin mekanismeihin, fytoestrogeenit voivat osallistua eturauhasen solujen kasvun endokriiniseen säätelyyn vaikuttamalla AR:n ja ERß:n väliseen tasapainoon. Testosteroni ja sen metaboliitti 5α-dihydrotestosteroni (DHT) aiheuttavat eturauhasen epiteelisolujen lisääntymistä sitoutumalla AR:hen. Sitä vastoin ERß:aan sitoutumalla 5α androstaani-3ß,17ß-dioli (3ßadioli), DHT:n metaboliitti, tukahduttaa AR:n ilmentymisen ja estää siten androgeenivetoisen lisääntymisen samalla kun se edistää solujen erilaistumista. Mitä tulee proliferaatioon, nykyiset tiedot viittaavat ERa:n ja AR:n yhdistettyyn stimuloivaan rooliin eturauhasessa, kun taas ERß estää proliferaatiota ja stimuloi erilaistumista. Sekä estrogeenilla ERα että ß:lla on affiniteettia estradioliin, kun taas fytoestrogeenit ja 3ßadioli aktivoivat selektiivisesti ERß:n. Tämän seurauksena fytoestrogeenien pitäisi pystyä rajoittamaan syövän kasvua toimimalla 3ßadiolin korvikkeena. Tämä on vahvistettu kokeellisilla tutkimuksilla.

Aiempien interventiotutkimusten tulokset ovat antaneet lupaavia tuloksia, jotka osoittavat, että tietyt ruokavalion tai elämäntapamuutokset voivat vaikuttaa eturauhassyövän etenemiseen, vaikka useimmat näistä tutkimuksista ovat olleet melko lyhytkestoisia ja perustuvat suhteellisen pieneen potilasmäärään. Esimerkiksi satunnaistettu tutkimus osoitti, että miehillä, joille annettiin ruokavalioon lisättyä pellavansiemeniä, oli pienempi prosenttiosuus positiivisia soluja, jotka sisälsivät proliferaatiomarkkerin Ki-67, kuin miehillä, jotka eivät olleet saaneet tätä lisäystä ruokavalioonsa. Yhdessä nykyiset todisteet viittaavat siihen, että eturauhassyöpäpotilailla on mahdollisuus täydentää elämäntapaan liittyviä hoitovaihtoehtoja kasvaimen etenemisen estämiseksi tai viivästymiseksi.

Erityinen tavoite: Suorittaa kontrolloitu satunnaistettu ruokavaliointerventiotutkimus eturauhassyöpää sairastavilla miehillä. Tutkijat pyrkivät seuraaviin erityisiin tavoitteisiin/hypoteesiin:

1. "Keskitason riskitason eturauhassyöpää sairastavilla miehillä runsas fytoestrogeenipitoinen ruokavalio vähentää kasvaimen etenemistä verrattuna miehiin, joiden ruokavalio on vähäinen kasviestrogeenitasolla."
2. "Runsasta fytoestrogeenia sisältävän ruokavalion vaikutukset eturauhassyövän kasvaimen etenemiseen vaihtelevat miesten välillä, joilla on eri genotyyppisiä polymorfismeja ERß-geenissä". Miehet jaetaan ERß-geenin yhden nukleotidin polymorfismin (SNP) rs2987983-13950 T/C kahteen alaryhmään, joissa hypoteesia testataan.
3. Sen määrittämiseksi, eroaako AR:n, ERa:n ja ERp:n RNA-ilmentyminen eturauhasen kasvainkudoksessa sekä steroidihormonien tasot miesten välillä, joiden ruokavalio on runsas ja vastaavasti vähäinen, tai ERβ-geenin eri genotyyppien välillä.
4. Sen määrittämiseksi, eroaako proliferaatioon osallistuvien geenien ja ER-signaalireittien mRNA-ilmentyminen, joka on analysoitu koko transkriptomalla profiloinnilla eturauhasen poistonäytteissä, miesten välillä, joiden ruokavalio on korkea ja vastaavasti vähäinen fytoestrogeeneissä, tai ERβ-geenin eri genotyyppien välillä.

Tutkimusprotokolla: Tutkijat tunnistavat hoitavien lääkäreiden kautta 240 miestä Länsi-Götalanlandin terveydenhuoltoalueella, joilla on diagnosoitu keskitason riskitason eturauhassyöpä (T1-T2, Gleason-pisteet).

Interventio: Potilaat perehdyttää interventioruokavalioon ravitsemusterapeutin toimesta ja he saavat yleistä tietoa terveellisistä ruokavalinnoista (suuren yleisön suositusten mukaan) ja olla syömättä ravintolisiä, muita ruokavaliorajoituksia ei anneta. Potilaille toimitetaan päivittäin nautittava pakkaus, joka sisältää runsaasti fytoestrogeenia (≥100 mg isoflavonoideja ja ≥100 mg lignaaneja) sisältävää ruokaa. Interventio jatkuu leikkausta edeltävään päivään saakka (vähintään 6 viikkoa). Kontrolliryhmän potilaille tiedotetaan samalla tavalla kuin interventioryhmälle, paitsi että he eivät saa mitään ruokapakettia.

Päätepiste: Ruokavalion vaikutus kasvaimen lisääntymisnopeuteen mitataan vertaamalla 1) positiivisten solujen prosenttiosuutta, jotka sisältävät markkerin Ki-67, 2) PSA-tasoja, 3) proliferaatioon ja ER-signaalireitteihin osallistuvien geenien ilmentymistä ja solusyklin etenemisen (CCP) geenin ilmentyminen. Leikkauksen välittömästä vierestä kirurgi ottaa neljä mediaanineulabiopsiaa tuoreesta eturauhasnäytteestä, kaksi kasvainpaikasta ja kaksi terveestä eturauhaskudoksesta aiempien diagnostisten biopsioiden ja magneettikuvauksen tulosten perusteella. Myös leikkauksessa , radikaali prostatektomiakudokset kerätään ja formaliinikiinnitetty parafiini upotetaan. Verinäytteet otetaan tutkimuksen alussa, leikkausta edeltävänä päivänä ja lähetetään PSA-analyysiin (ilmainen ja kokonaismäärä). PSA-tasojen ja PSA:n kaksinkertaistumisajan absoluuttiset erot lasketaan. Lisäksi tutkijat mittaavat AR:n, ERα:n ja ERß:n ilmentymistä kasvainkudoksessa sekä hormonien, testosteronin, DHT:n, estradiolin ja 3ß-adiolin pitoisuuksia veressä.

Kyselylomake: Kaikki potilaat vastaavat salasanalla suojattuun kyselyyn lähtötilanteessa, leikkaus, paino ja pituus mitataan. Kerran 6 viikon aikana suoritetaan 24 tunnin muistohaastattelu, jossa rekisteröidään osallistujien ruokailu edellisen 24 tunnin aikana. Yksittäinen energian ja tiettyjen ravintoaineiden saanti arvioidaan linkittämällä kyselylomakkeen ja ruokavaliotietueen tiedot Elintarvikeviraston ravintotietotietokantaan ja aiemmin kehitettyyn kasviestrogeenitietokantaan. Tietoja 5α-reduktaasin estäjän Finasteridin mahdollisesta käytöstä kerätään lääketieteellisistä asiakirjoista.

Polymorfien:SNP-analyysi ERß-geenissä analysoidaan verinäytteistä käyttäen PCR-pohjaista menetelmää kompetitiivisella alleelispesifisellä PCR:llä (KASP™). Alleelirakenne tunnistetaan ja osallistujat jaetaan ryhmään TT, TC tai CC. Ki-67:n analyysi: Biopsianäytettä kiinnitetään upottamalla 4 % paraformaldehydiin 0,1 M fosfaattipuskuriin 24 tunnin ajan +4°C:ssa. Sitten se kuivataan asteittain etanolilla, minkä jälkeen upotetaan ksyleeniä ja parafiinia. Parafiinileikkeitä kuumennetaan 30 minuuttia 60 ºC:ssa, esikäsitellään sitruunahappopuskurilla. Epäspesifinen sitoutuminen estyy aasin seerumilla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisältää Triton X-100:aa 30 minuutin ajan. Inkuboidaan Ki-67-vasta-aineen kanssa yön yli (4 ºC), minkä jälkeen inkuboidaan sopivan sekundaarisen biotinyloidun vasta-aineen kanssa. Signaalin tehostamiseksi leikkeitä käsitellään avidiini-biotiini-kompleksiliuoksella ja immunoreaktiivisuuden visualisoimiseksi käytetään diaminobentsidiiniä (DAB). Värjäytyneet kasvainsolut (Ki-67-positiivisuus) lasketaan ja tulos raportoidaan positiivisten tumien suhteena jaettuna arvioidulla kokonaismäärällä × 100.

Reseptorin ilmentymisen, CCP-pistemäärän, hormonitasojen ja PSA:n analyysi: Leikkauksessa otetut kudosnäytteet asetetaan RNA:han myöhemmin ennen jäädyttämistä. Näytteet analysoidaan käyttämällä RNeasy plus Universal Mini Kits -sarjaa (QIAGEN) ja reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiota (PCR). ERa-, ERp- ja AR-mRNA-ilmentyminen määritetään käyttämällä TaqMan-määritystä. Kokonais-RNA uutetaan formaliinilla kiinnitetyistä parafiiniin upotetuista kasvainten ja hyvänlaatuisten kudosten osista käyttämällä maailmanlaajuista transkription kattavaa ilmentymistaulukkoa Clariom ™ D (Thermos Fischer). CCP-pistemäärän analysointia varten CCP:hen osallistuvien geenien geeniekspressio perustuu Prolaris®-geenipaneeliin ja Decipher Score -arvoon. Veren PSA-tasot analysoidaan standardin kliinisen protokollan mukaisesti.

Teholaskenta: Länsi-Götanmaan terveydenhuoltoalueella vuonna 2012 321 miehellä oli keskitason riskitason eturauhassyöpä, johon he saivat parantavaa hoitoa. Ensisijaista tulosta (Ki-67) käyttävä laskelma antaa 118 potilaasta koostuvan tutkimusryhmän osalta 80 % tehon kaksipuoliseen kokeeseen, jonka merkitsevyystaso on 0,05 ja vaikutuskoko 0,5. Aiemmissa tutkimuksissa tutkijat havaitsivat, että noin 42 % miespopulaatiosta on heterotsygoottisia tai homotsygoottisia ERβ-promoottorialueen SNP:n varianttialleelin (TC/CC) suhteen (rs2987983-13950 T/C) ja 58 % homotsygoottisia villityypin alleelin suhteen. (TT). Koska tutkijat odottavat intervention vaikutuksen olevan suurempi koehenkilöillä, joilla on varianttialleeli, kun taas pienempi villityypin alleelin omaavilla koehenkilöillä, tämän jälkimmäisen ryhmän pitäisi olla tarpeeksi suuri voidakseen löytää eron, jos sellainen on olemassa. Näin ollen kokonaisotoksen koko on 118/58 % = 203 potilasta.

Tilastolliset näkökohdat: Tutkijat käyttävät aikomus-hoitomenetelmää. Suunnittelussa ja tiedonkeruussa on tehty lääkkeiden testaus mallina (satunnaistaminen, lumelääke, sokkouttaminen, ei kulumista, ei differentiaalimittausvirheitä, oikea analyysi); poikkeamien täydellisestä tilanteesta tutkijat käyttävät epidemiologista teoriaa analyysien ohjauksessa ja tulosten tulkinnassa. Alustavat analyysit, jotka perustuvat keskiarvoihin, mediaaneihin, standardipoikkeamiin ja interkvantiilialueeseen, tarjotaan kuvaamaan asianmukaisesti kiinnostavia tuloksia, ja ositus suoritetaan määritetyn ruokavalion satunnaistamisen tehokkuuden arvioimiseksi. Tästä syystä tuotetaan laatikkokaavioita vasteen ajallisten kehityssuuntausten graafisen arvioimiseksi. Tulosten jakautumista tutkitaan ja soveltuvia muunnoksia sovelletaan tarvittaessa symmetrian ja normaaliuden parantamiseksi. Aineiston pitkittäisrakenteesta johtuen sisällytetään havaintojen välinen korrelaatio ja lineaarisilla sekavaikutusmalleilla tutkitaan, onko (i) olemassa ajallinen trendi (ii) onko lineaarinen trendi eroa hoidettujen ja hoitamattomien yksilöiden välillä (iii) ) jos hoitovaikutusta interventioryhmän ja kontrolliryhmän välillä muutetaan ERß-genotyyppien mukaan sekä yleisen että muunnelman osalta. Keskeinen vaihe pitkittäistietojen analysoinnissa on tunnistaa sopiva kovarianssirakenne, joka kuvaa datapisteiden välisiä korrelaatioita: riippumaton kovarianssi (ei korrelaatiota), vaihdettava kovarianssi (yhtä korrelaatio) tai autoregressiivinen kovarianssi, jossa vasteiden välinen korrelaatio pienenee mittausten välisen ajan myötä. Tutkijat tunnistavat sopivimman rakenteen, joka varmistetaan empiirisesti informaatioteoreettisen lähestymistavan avulla. Vaikutusten merkittävyyden arvioimiseksi tuotetaan sekä tilastollisia testejä että luottamusväliä, joten pää- ja vuorovaikutusmuuttujien yhteisvaikutusta tutkitaan osittaisilla F-testeillä ja mallinsovituksen tutkimiseen soveltuvia tilastollisia menetelmiä. Fysioestrogeenien saannin ja syövän lisääntymisen välistä yhteyttä arvioidaan yleistetyillä lineaarisilla malleilla, jotka antavat arvioita riskierosta (RD) ja vastaavasta 95 % CI:stä ERβ-genotyyppien mukaan ositettuna. Vuorovaikutuksia fytoestrogeenin saannin ja ERβ SNP:iden proliferaatiossa arvioidaan ottamalla huomioon lisävaikutusasteikot. Kasvien estrogeenien saannin ryhmä sisällytetään jatkuvana muuttujana, ja jokaista SNP:tä edustaa indikaattorimuuttuja (variantti tai ei). Vuorovaikutus arvioidaan lineaarisessa odds-mallissa tuotetermillä kasviestrogeenin saantia edustavien kovariaattien ja SNP-genotyyppien välillä.