唾液能否成为监测儿童口腔健康的新型生物流体？

唾液诊断是一个新兴领域，通过几个重要的发展取得了进步，包括唾液蛋白质组和用于快速分析的紧凑型床旁设备的开发。 事实上，越来越多的唾液标记物已经被发现；有些与癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病、病毒和细菌性疾病以及人体免疫缺陷有关。 唾液因其简单、无创、快速收集而经常被研究，不需要专门的设备。 此外，唾液这一巨大的流体来源提供了很多（如果不是大部分的话）体循环中发现的分子，使其成为一种潜在的有价值的诊断生物流体。

已在唾液中检测到与口腔疾病以及全身性疾病相关的几种炎症生物标志物。 在这方面，细胞因子是研究最多的生物标志物之一。 由于它们参与炎症、感染和免疫疾病，细胞因子可作为局部口腔病理学（如牙周病和牙周病）的标志物。 事实上，在成年人中，有证据表明可以通过唾液生物标志物检测此类疾病，例如白介素 (IL)-1b、-6、-8 和 -10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和基质金属蛋白酶（MMP )-8 和 -9 成人。 此外，由于牙龈炎等口腔病理学的一些病因包括细菌感染，如链球菌、梭杆菌、放线菌、韦荣球菌、密螺旋体、二氧化碳嗜纤维菌和艾肯氏菌，唾液也可用于测量细菌负荷。

龋齿是世界上最常见的儿童疾病之一，与牙齿表面的多种微生物定植有关。 产酸菌和产酸菌，例如变形链球菌和乳杆菌，都是龋齿的主要病原体。 乳杆菌和变形链球菌大多同时存在于唾液中。 唾液中微生物的多样性已被证明会增加龋齿的活跃状态。 据报道，在有空洞龋齿病变的儿童中，细胞因子 IL-6 和 IL-8 的浓度发生了变化。

本研究的目的是描述健康儿童唾液的炎症和微生物特征，并将这些水平与龋齿和牙龈疾病的临床诊断联系起来。

材料和方法 研究人群 研究人群包括 100 名参与者，出生于 2008-2016 年（研究时年龄为 4-12 岁）。

临床口腔检查

两名牙科学生使用牙镜、牙科探查器和牙科探针进行了牙科检查，包括以下参数：

• 口腔卫生 - 如前所述，18 仅通过口腔表面的牙菌斑指数 (PI) 进行测量。
• 牙周状态 - 通过牙龈指数 (GI) 测量，如前所述
• 通过 DMFT/dmft 指数（D=龋齿，M=缺失，F=填充；每颗牙齿 T）测量恒牙/乳牙列中的龋齿状态。 所有的值都被收集并记录在数据表中。

唾液收集 在 0800 和 1230 小时之间在一个安静的房间里收集唾液。 要求儿童收集口中的唾液，吐入宽试管中 3 分钟。 唾液立即储存在 4°C，并进一步保存在 -80°C 直至分析。 数据被收集到纸质图表上，然后被传输到计算机程序中。

细菌检测 使用 DNA 提取试剂盒 (Qiagen) 从唾液中提取细菌 DNA。 然后使用针对总细菌的特异性引物测试 DNA：链球菌。 使用定量实时聚合酶链反应的变形杆菌、乳杆菌和具核梭杆菌。

唾液细胞因子定量人类 TNF-α、IL-10、IL-8 和 IL-6 的唾液水平根据制造商的说明（R&D 系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）使用 ELISA 试剂盒测量。 唾液样本被转移到 Hadassah Ein Kerem 医院的牙周实验室进行分析。 ELISA 方法通过放置在 96 孔板中的细胞因子碳酸盐特异性单克隆抗体起作用。 将 µL 83 唾液稀释至 10 ml 抗体捕获 PBS 后，将活性溶液与抗体一起放入孔中，并在室温下覆盖过夜。 随后，我们用 µL 400（缓冲液清洗）清洗并重复此步骤三次。 然后，我们通过在室温下添加 µL 300 稀释剂试剂一小时来封闭孔，然后如上所述再次清洗。 我们以 100 µL 稀释，盖上盖子并在室温下孵育 2 小时。 然后再次冲洗，加入浓度为166 µL至10 ml的检测抗体，盖上孵育2小时。 接下来，我们添加生物素相关抗体，然后添加 HRP-链霉亲和素偶联物，并以 TMB 作为底物。 用硫酸终止反应并使用 650nm-OD490 进行定量。

统计分析所有实验一式三份进行。 数据根据年龄、DMF、PI和GI分层。 根据牙龄分为三个年龄组：乳牙列——0-6岁；混合牙列 - 6-11 岁；和恒牙列 - 11 岁以上。 DMFT 按≤2 和 >2 分层。 PI 按≤1 和>1 分层。 GI 按等于零和高于零进行分层。 使用统计软件包（SigmaStat，Jandel Scientific，San Rafael，CA，USA）分析数据。 应用单向重复测量方差分析 (RM ANOVA) 来检验治疗组之间差异的显着性。 当发现显着结果时，使用学生 t 检验和针对多重检验的 Bonferroni 校正检验组间差异的显着性。 统计显着性设定为 p<0.05。