Czy ślina może być nowym biopłynem do monitorowania zdrowia jamy ustnej dzieci?

Diagnostyka śliny to wschodząca dziedzina, która przeszła kilka ważnych zmian, w tym proteom śliny i rozwój kompaktowych urządzeń do szybkiej analizy w miejscu opieki. Rzeczywiście, zidentyfikowano rosnącą liczbę markerów śliny; a niektóre były związane z rakiem, chorobami układu krążenia, chorobami autoimmunologicznymi, chorobami wirusowymi i bakteryjnymi oraz ludzkim niedoborem odporności. Ślina jest często badana ze względu na łatwe, nieinwazyjne i szybkie jej pobranie, bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Co więcej, ogromne płynne źródło śliny dostarcza wielu, jeśli nie większości, cząsteczek znajdujących się w krążeniu ogólnoustrojowym, co czyni ją potencjalnie cennym płynem biologicznym do diagnozy.

W ślinie wykryto kilka typów biomarkerów zapalnych związanych z chorobami jamy ustnej, a także chorobami ogólnoustrojowymi. Cytokiny należą do najczęściej badanych biomarkerów w tym kontekście. Ze względu na swój udział w chorobach zapalnych, zakaźnych i immunologicznych, cytokiny mogą służyć jako markery lokalnych patologii jamy ustnej, takich jak choroby przyzębia i próchnica. Rzeczywiście, u dorosłych dowody wskazują, że taką chorobę można wykryć za pomocą biomarkerów śliny, takich jak interleukiny (IL)-1b, -6, -8 i -10), czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α) i metaloproteinazy macierzy (MMP )-8 i -9 u dorosłych. Dodatkowo, ponieważ niektóre etiologie patologii jamy ustnej, takie jak zapalenie dziąseł, obejmują infekcje bakteryjne, takie jak Streptococcus, Fusobacterium, Actinomyces, Veillonella, Treponema, Capnocytophaga i Eikenella, do pomiaru obciążenia bakteryjnego można również wykorzystać ślinę.

Próchnica zębów jest jedną z najczęstszych chorób wieku dziecięcego na całym świecie i jest związana z kolonizacją wielu drobnoustrojów na powierzchni zębów. Zarówno bakterie kwasotwórcze, jak i kwasotwórcze, takie jak Streptococci z grupy Mutans i Lactobacilli, są głównymi czynnikami etiologicznymi próchnicy zębów. Lactobacilli i S. Mutans występują najczęściej razem w ślinie. Wykazano, że różnorodność drobnoustrojów w ślinie zwiększa się wraz ze statusem aktywnej próchnicy. U dzieci z ubytkami próchniczymi ubytkowymi stwierdzono zmienione stężenia cytokin IL-6 i IL-8.

Celem pracy było scharakteryzowanie stanu zapalnego i mikrobiologicznego śliny zdrowych dzieci oraz powiązanie tych poziomów z kliniczną diagnostyką próchnicy i chorób dziąseł.

Materiały i metody Populacja badana Populacja badana liczyła 100 osób urodzonych w latach 2008-2016 (w momencie badania w wieku 4-12 lat).

Kliniczne badanie jamy ustnej

Badania stomatologiczne zostały przeprowadzone przez dwóch studentów stomatologii za pomocą lusterka dentystycznego, eksploratora dentystycznego i sondy dentystycznej i obejmowały następujące parametry:

• Higiena jamy ustnej – mierzona wskaźnikiem płytki nazębnej (PI), jak opisano wcześniej,18 tylko na powierzchniach policzkowych.
• Stan przyzębia – mierzony za pomocą wskaźnika dziąseł (GI), jak opisano wcześniej
• Stan próchnicy mierzony wskaźnikiem DMFT/dmft (D=próchnica, M=brak, F=wypełnienie; T na ząb) w uzębieniu stałym/mlecznym. Wszystkie wartości zostały zebrane i zapisane w tabeli danych.

Pobieranie śliny Ślina została pobrana w cichym pomieszczeniu między godziną 0800 a 1230. Dzieci proszono o zbieranie śliny w ustach i wypluwanie jej do szerokiej probówki przez 3 min. Ślina była natychmiast przechowywana w temperaturze 4°C i dalej utrzymywana w temperaturze -80°C do czasu analizy. Dane zbierano na papierowych wykresach, które przenoszono do programu komputerowego.

Badanie bakterii Bakteryjny DNA ekstrahowano ze śliny za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (Qiagen). Następnie DNA przetestowano przy użyciu specyficznych starterów dla wszystkich bakterii: Strep. Mutans, Lactobacillus i Fusobacterium nucleatum przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Oznaczanie ilościowe cytokin w ślinie Poziomy ludzkiego TNF-α, IL-10, IL-8 i IL-6 w ślinie mierzono stosując zestawy ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (systemy R&D, Minneapolis, MN, USA). Próbki śliny przekazano do analizy do laboratorium periodontologicznego w szpitalu Hadassah Ein Kerem. Metoda ELISA polega na umieszczeniu przeciwciała monoklonalnego swoistego dla węglanu cytokiny w 96-studzienkowej płytce. Po rozcieńczeniu µL 83 śliny do 10 ml PBS wychwytującego przeciwciała, aktywny roztwór umieszcza się z przeciwciałem w studzience i przykrywa przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie przemywamy µL 400 (płukanie buforem) i powtarzamy ten krok trzy razy. Następnie blokujemy dołki przez dodanie µL 300 odczynnika rozcieńczającego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej i ponownie przemywamy, jak opisano powyżej. Rozcieńczamy do 100 µL, przykrywamy i inkubujemy przez 2 godziny w temp. pokojowej. Następnie ponownie płuczemy i dodajemy przeciwciało wykrywające w stężeniu 166 µl na 10 ml, przykrywamy i inkubujemy przez 2 godziny. Następnie dodajemy przeciwciało związane z biotyną, a następnie koniugat HRP-streptawidyna i TMB jako substrat. Reakcję zatrzymuje się kwasem siarkowym i ocenia ilościowo stosując 650 nm-OD490.

Analiza statystyczna Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Dane stratyfikowano według wieku, DMF, PI i GI. Ze względu na wiek zębowy wyznaczono trzy grupy wiekowe: uzębienie mleczne - wiek 0-6 lat; uzębienie mieszane - wiek 6-11 lat; i uzębienie stałe - powyżej 11 roku życia. DMFT stratyfikowano przez ≤2 i >2. PI stratyfikowano przez ≤1 i >1. IG został podzielony na równe zero i powyżej zera. Dane analizowano za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego (SigmaStat, Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). Zastosowano jednokierunkową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami (RM ANOVA) w celu zbadania istotności różnic między leczonymi grupami. Gdy znaleziono istotne wyniki, różnice międzygrupowe testowano pod kątem istotności, stosując test t-Studenta i poprawkę Bonferroniego dla testów wielokrotnych. Istotność statystyczną ustalono na p<0,05.