Kan saliv vara den nya biovätskan för att övervaka barns munhälsa?

Salivdiagnos är ett framväxande område som har utvecklats genom flera viktiga utvecklingar, inklusive salivproteom och utvecklingen av kompakta point-of-care-enheter för snabb analys. Faktum är att ett ökande antal salivmarkörer har identifierats; och några har associerats med cancer, kardiovaskulära sjukdomar, autoimmuna sjukdomar, virus- och bakteriesjukdomar och mänsklig immunbrist. Saliv studeras ofta på grund av den enkla, icke-invasiva och snabbt erhållna insamlingen, utan behov av specialutrustning. Dessutom tillhandahåller den fantastiska vätskekällan av saliv många, om inte de flesta, av de molekyler som finns i den systemiska cirkulationen, vilket gör den till en potentiellt värdefull biovätska för diagnoser.

Flera typer av inflammatoriska biomarkörer associerade med orala sjukdomar, såväl som systemiska sjukdomar, har upptäckts i saliv. Cytokiner är bland de mest undersökta biomarkörerna i detta sammanhang. På grund av deras inblandning i inflammatoriska, infektionssjukdomar och immunologiska sjukdomar kan cytokiner fungera som markörer för lokala orala patologier såsom parodontala sjukdomar och bär. Faktum är att hos vuxna visar bevis på att sådan sjukdom kan detekteras genom salivbiomarkörer som interleukiner (IL)-1b, -6, -8 och -10), tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) och matrismetalloproteinaser (MMP) )-8 och -9 hos vuxna. Dessutom, eftersom vissa etiologier av oral patologi som gingivit inkluderar bakterieinfektioner såsom Streptococcus, Fusobacterium, Actinomyces, Veillonella, Treponema, Capnocytophaga och Eikenella, kan saliv också användas för att mäta bakteriell belastning.

Tandkaries är en av de vanligaste barnsjukdomarna i världen och är förknippad med polymikrobiell kolonisering på tandytor. Både acidogena och sura bakterier, såsom Mutans-gruppen av streptokocker och laktobaciller, är primära etiologiska medel för tandkaries. Laktobaciller och S. Mutaner finns oftast tillsammans i saliv. Mångfalden av mikrober i saliv har visat sig öka i kariesaktiv status. Hos barn med kaviterade kariesskador rapporterades förändrade koncentrationer av cytokinerna IL-6 och IL-8.

Syftet med denna studie var att karakterisera den inflammatoriska och mikrobiologiska profilen av saliven hos friska barn, och att associera dessa nivåer med klinisk diagnos av karies och gingivalsjukdom.

Material och metoder Studiepopulation Studiepopulationen omfattade 100 deltagare, födda under 2008-2016 (i åldern 4-12 år vid tidpunkten för studien).

Klinisk muntlig tentamen

Tandundersökningar utfördes av två tandläkarstudenter med hjälp av en tandspegel, dental explorer och dental sond, och inkluderade följande parametrar:

• Munhygien - mätt med plackindex (PI), som beskrivits tidigare,18 endast på buckala ytor.
• Parodontal status - mätt med gingivalindex (GI), som beskrivits tidigare
• Kariesstatus mätt med DMFT/dmft-index (D=sönderfall, M=saknad, F=fyllning; T per tand) i permanent/primär dentition. Alla värden samlades in och registrerades i en datatabell.

Salivinsamling Saliven samlades in i ett tyst rum mellan 0800 och 1230. Barnen ombads att samla saliv i munnen och spotta den i ett brett provrör i 3 minuter. Saliven lagrades omedelbart vid 4°C och hölls vidare vid -80°C fram till analys. Data samlades in på pappersdiagram, som överfördes till ett datorprogram.

Bakterietestning Bakteriellt DNA extraherades från saliv med hjälp av DNA-extraktionssats (Qiagen). DNA:t testades sedan med användning av specifika primrar för totala bakterier: Strep. Mutaner, Lactobacillus och Fusobacterium nucleatum med hjälp av kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion.

Kvantifiering av salivcytokiner Salivnivåer av human TNF-a, IL-10, IL-8 och IL-6 mättes med användning av ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner (FoU-system, Minneapolis, MN, USA). Salivproverna överfördes till det parodontala laboratoriet på Hadassah Ein Kerem Hospital för analys. ELISA-metoden fungerar genom att en cytokinkarbonatspecifik monoklonal antikropp placeras i en platta med 96 brunnar. Efter utspädning av µL 83 saliv till 10 ml PBS antikroppsuppfångning, placeras den aktiva lösningen med antikroppen i brunnen och täcks över natten vid rumstemperatur. Därefter tvättar vi med µL 400 (bufferttvätt) och upprepar detta steg tre gånger. Vi blockerar sedan brunnarna genom att tillsätta µL 300 spädningsreagens i en timme vid rumstemperatur och tvätta igen enligt beskrivningen ovan. Vi späder vid 100 µL, täcker och inkuberar i 2 timmar vid rumstemperatur. Vi sköljer sedan igen och lägger till detektionsantikropp i en koncentration av 166 µL till 10 ml, täcker och inkuberar i 2 timmar. Därefter lägger vi till biotinrelaterad antikropp, följt av HRP-streptavidinkonjugat och TMB som substrat. Reaktionen stoppas med surt svavelsyra och kvantifieras med användning av 650 nm-OD490.

Statistisk analys Alla experiment utfördes i tre exemplar. Data stratifierades efter ålder, DMF, PI och GI. Tre åldersgrupper bestämdes efter dental ålder: primär dentition - åldrarna 0-6 år; blandad tandsättning - åldrarna 6-11 år; och permanent tandsättning - över 11 år. DMFT stratifierades med ≤2 och >2. PI stratifierades med ≤1 och >1. GI stratifierades med lika med noll mot över noll. Data analyserades med hjälp av ett statistiskt mjukvarupaket (SigmaStat, Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). Envägsanalys av upprepad mätning av varians (RM ANOVA) användes för att testa betydelsen av skillnaderna mellan de behandlade grupperna. När signifikanta resultat hittades testades skillnader mellan grupper för signifikans med hjälp av Students t-test och Bonferroni-korrigeringen för multipla tester. Statistisk signifikans sattes till p<0,05.