心耳微移植手术辅助心脏手术后的心脏修复 (AAMS2)

背景与意义

在全球范围内，每年有 1790 万人死于心血管疾病。 缺血性心脏病 (IHD) 是其中一半病例的病因，因此使其成为全球主要的单一死因 [GBD 2017]。 虽然全世界有 1.265 亿患者患有 IHD，但在欧洲有 3030 万患者 [Timmis 2018]。

IHD 的特点是冠状动脉粥样硬化斑块逐渐扩大。 这些疾病热点不仅驱动心肌缺氧、心肌细胞冬眠、细胞凋亡和间质纤维化，而且容易发生侵蚀和破裂。 斑块破裂强力激活止血系统，导致血栓性冠状动脉闭塞、心肌梗塞 (MI) 和心脏组织死亡。 由于急救护理得到改善，越来越多的患者在急性期存活下来，受伤部位最终被通常会限制心脏充盈和泵血的疤痕所取代 [Cohn 2000]。 根据受伤的程度和由此产生的疤痕，最终增加的工作量会导致不良重塑和心力衰竭 (HF) 的出现，这是一种不可逆和失能的临床综合征，预后不良 [Taylor 2017, Cohn 2000]。 据报道，由于缺血性病因导致的心力衰竭从 29% 到 45% 不等 [Groenewegen 2020]。 例如，最近的一项荟萃​​分析表明，在 65 岁以上的普通人群中，“所有类型”HF 患病率（包括之前通过基于人群的超声心动图筛查未发现的病例）高达 11.8% [van Riet 2016]。

CABG 手术是严重进展性 IHD 患者的首选血运重建方法 [Rihal 2003]。 在欧洲，2016 年进行了超过 245,000 例 CABG 手术 [Eurostat 2015]。 无论年龄如何，CABG 手术已被证明对缺血症状和死亡率具有总体有益影响 [Freitas 2019]。

通过再生而不是疤痕形成的心脏愈合可以使 IHD 及其并发症倾向于一种越来越可控、甚至可治愈的疾病。 虽然一些脊椎动物的心脏在其整个生命周期中通过再生来愈合，但在啮齿动物中，这种能力仅限于生命的第一周 [Cutie 2021]。 在生命的早期，人的心脏似乎也具有在缺血后再生的能力 [Haubner 2016]。

在成人心脏中激活心脏再生修复已被证明是复杂的。 许多干细胞、祖细胞和分化细胞已经在这方面进行了测试 [Cambria 2017]。 虽然这些研究提供了可喜的结果，但治疗仍然复杂且昂贵，突出表明需要更直接的临床方法。 来自心耳的细胞已被证明能够在缺血性心脏损伤的情况下刺激再生性心脏愈合 [Koninckx 2013，Detert 2018，Evens 2021]。 正如欧洲心脏病学会所定位的那样，许多组织工程方法，包括心外膜细胞外基质 (ECM) 补片移植，被强调为有前途的缺血性心力衰竭的未来疗法 [Madonna 2019]。 这些方法可以提高共同移植细胞的局部持久性和活力——这是先前研究中发现的一个主要障碍。

一般概念

我们使用患者自己的右心耳心脏组织进行治疗。 左心耳和右心耳（分别为左心耳和右心耳）均不直接影响心脏的泵血功能。 在 CABG 开始时设置心肺机期间插入右心房插管后，可以安全地采集一块 RAA [Lampinen 2017，Nummi 2017，Nummi 2021]。 在 AAMS2 试验中，一块 RAA 组织被用作心外膜移植、贴片包裹和机械扩张的心耳微移植物 (AAM)。 这种疗法可以在单次 CABG 手术期间进行。

先前的结果

在 MI 和 HF 的临床前小鼠模型中，将心外膜 AAM 贴片的效果与非细胞 ECM 贴片进行了比较。 结果表明，心肌组织得到保护，瘢痕形成减弱，心脏功能得以保留 [Xie 2020]。 此外，基于质谱的定量蛋白质组学证明了心肌广泛的再生和心脏保护作用，包括减少氧化应激和 AAMs 介导的心肌糖酵解代谢诱导，这一过程与心肌再生能力增加有关 [Lalowski 2018，Nakada 2017，木村 2015，普恩特 2014]。

AAMs 贴片疗法已进入临床使用。 继首次在人体中应用 AAMs [Nummi 2019] 之后，最近证实了 CABG 期间心外膜 AAMs 移植的安全性和可行性 [Nummi 2021]。 此外，由于这项研究表明瘢痕区存活心肌的厚度增加，因此它提供了治疗益处的第一个迹象 [Nummi 2021]。

目标和概述

这项 AAMS2 随机双盲对照试验评估了心外膜移植 AAM 作为 CABG 手术辅助治疗的效果。 该试验的主要终点是与术前 LGE-CMRI 相比，在术后 6 个月的随访中使用晚期钆增强心脏磁共振成像 (LGE-CMRI) 评估心脏功能和结构的变化。

该试验以 1:1 的组分配比例将 50 名患者纳入研究组（CABG 或 AAMs 贴片加 CABG）。 在 CABG 期间从所有参与者的 RAA 中采集自体 RAA 组织，并根据随机化，将 RAA 组织块在围手术期处理成 AAM 或冷冻保存以进行生化分析。 嵌入纤维蛋白基质凝胶中的 AAM 被放置在 ECM 片上，然后通过心外膜缝合到位。 为了将缺血疤痕区域确定为心外膜移植部位，术前进行了 LGE-CMRI。 研究血液样本在术前以及术后 3 个月和 6 个月的随访中采集。 术前和 6 个月随访时进行经胸超声心动图 (TTE)、LGE-CMRI、症状分级测量和 6 分钟步行试验 (6MWT)。

方法

1. 患者选择、登记、伦理和时间表——经心脏病专家评估，符合资格和排除标准的患者选自医院的择期心脏手术名单。 治疗心脏病专家根据现行指南优化患者的药物治疗。 名单上的通常等待时间在 2 到 8 周之间。 这个时间允许药物改变在手术前生效。 随后，招募的患者被要求进行临床对照访问（表示为 3 个月的随访）和专门的试验访问（术后 6-8 个月，表示为 6 个月的随访）。

   向所有患者提供描述试验的信息。 在受试者进行任何研究程序之前，将进行知情同意讨论，并且需要书面知情同意才能参与。 该试验将遵循赫尔辛基关于涉及人类受试者的医学研究伦理原则的宣言 [世界医学协会 2013 年]。 该研究已获得赫尔辛基和 Uusimaa 医院区伦理委员会 (HUS; Dnr. HUS/12322/2022）。 患者招募的预计开始时间为 2022 年 12 月，预计全面研究完成日期为 2025 年 12 月。 如果在药物优化后无法识别可见疤痕且术前 LGE-CMRI 左心室射血分数 (LVEF) ≥ 50%，则参与者被排除在试验之外（筛选失败）。 如果在 CABG 之前未执行 LGE-CMRI，这也适用。

2. 终点——试验终点列在单独的部分中。 主要终点集中于通过 LGE-CMRI 评估的心脏纤维化变化和脑利钠肽 N 末端激素原（NT-proBNP）的循环水平。 次要终点集中于其他疗效参数以及治疗的安全性和可行性。
3. 随机化和盲法——通过 www.sealedenvelope.com 上公开可用的在线工具，使用性别分层块随机化将患者随机分为 CABG 或 AAMs 组 块大小为 2 和 4，并根据性别（女性、男性）进行分层。 随机化由赫尔辛基大学（负责人 docent Esko Kankuri）进行。 将带有随机分配信息的连续编号密封信封分发给研究护士，护士在每位患者的手术开始时打开每个相应的信封。 研究护士以双盲方式监督分配，其中患者和评估心脏病专家和放射科医生对研究组分配不知情。 鉴于治疗的性质（移植与不移植），不可能让手术外科医生或研究护士对分配视而不见。 所有 LGE-CMRI 和 TTE 测量以及实验室分析均由对组分配不知情的研究人员完成。
4. 心耳显微移植物的制备和给药——在心脏手术开始时通过右心房插管采集 RAA 片。 如前所述 [Lampinen 2017、Nummi 2017、Nummi 2021]，使用 Rigeneracon 刀片（Rigenera-system，HBW s.r.l.，都灵，意大利）对 RAA 组织进行称重并机械加工成微移植物。 从 EpiHeart Oy（芬兰赫尔辛基）获得用于支持手术室组织处理的专用 CE 标记仪器套件。 将微移植物铺展在心包基质片上（马心包贴片，Autotissue GmbH，德国柏林），并嵌入少量稀释的纤维蛋白组织胶中（Tisseel，Baxter AG，维也纳，奥地利）。 AAMs 贴片在等待移植时保持冷却 (+6 - +8C)、覆盖和无菌。
5. 一般数据保护条例——试验期间收集的数据将符合欧盟关于个人健康数据保护的规定，包括一般数据保护条例 (GDPR)。
6. 血样 - 用于 NT-pro-BNP 测量的血样，一种 HF 评估的金标准生物标志物 [McKie 2016]，在术前以及 3 个月和 6 个月的随访中收集。 此外，AAMS2 试验还评估了血液、血浆和 RAA 组织样本中所含的 RNA 转录本，并将新的重点放在它们的转录后修饰上，如前所述 [Sikorski 2021, Sikorski 2022]。 然而，为了确保足够的天然 RNA 产量，不是每次访问收集 3 mL x 5 的 TEMPUS(TM) RNA 稳定化血液，而是收集 3 mL x 8。 这些修饰构成了遗传学的生物学前沿，揭示了许多细胞功能和病理生理状况的关键贡献者和调节者，还有 IHD 和缺血性 HF [Qin 2021, Sikorski 2022]。 由于有关人类 IHD 和 HF 血液表观转录组学的信息仍然很少 [Sikorski 2022]，AAMS2 试验旨在深入了解 AAMs 治疗引起的血液表观转录组改变。 特别是，重点是两种最常见的修饰，N6-甲基腺苷 (m6A) 和腺苷-肌苷 (A-to-I) 编辑。
7. RAA 组织样本-从对照组中取出的 RAA 组织片被收集作为生化分析的样本。 RAA 组织片将一分为二并储存（RNAlater 或甲醛-乙醇），用于后续的表观转录组学靶向评估，如前所述 [Sikorski 2021]。
8. 超声心动图——所有参与者在术前和术后 6 个月的随访中均接受心电图和 TTE 评估。 TTE 记录由指定的心脏病专家进行。 这些记录包括心室、心房和瓣膜的解剖学和功能评估。 在术前 TTE 期间，在上述 AAM 的 RAA 样本收集之前，对心耳和心房进行特殊关注，以进行解剖学表征。 此外，记录是否存在心包积液、血栓和动脉瘤。 灌注麻醉师将在麻醉期间在手术室进行经食管超声心动图 (TEE)，以评估左右心耳的血流速度、CABG 前可能存在的淤泥和血栓。
9. 晚期钆增强心脏磁共振成像 (LGE-CMRI) - 全身 1.5-T MRI 扫描仪（Siemens Sola 或 Avanto-fit，Siemens AG，​​Erlangen，Germany）用于 LGE-CMRI 图像采集。 心脏结构和功能通过使用心电图和呼吸门控的标准化 LGE-CMRI 方案进行评估。 短轴电影图像用于左心室和右心室容积测量。 使用来自短轴和长轴电影图像的纵向、圆周和径向应变测量来评估心肌收缩力。 LGE 被评估为使用 5-SD 半自动增益估计来测量梗塞体积和质量，正如之前建议的用于梗塞检测的半自动阈值 [Schulz-Menger 2020]。 图像后处理是使用带有 QMass 和 QStrain 应用程序的 Medis Suite 软件（Medis Medical Imaging Systems，Leiden，The Netherlands）进行的。
10. 生活质量评估——健康相关生活质量 (HRQoL) 使用 RAND36 (SF36) 简短问卷 [Hays 2001] 进行测量。 调查问卷使用指定的平均值和标准偏差值对八个维度进行了标准化，这些维度从身体机能和对活力和健康的主观感觉到身体疼痛。 将获得的分数与患有任何慢性疾病的芬兰队列进行比较。 此外，使用加拿大心血管协会 (CCS) 和纽约心脏协会 (NYHA) 分别开发的标准化分类系统，对 IHD 和 HF、心绞痛和劳力性呼吸困难这两种主要症状进行受试者的症状评估 [ Campeau 1976，罗素 2009]。 最后，评估六分钟步行测试 (6MWT) 以获得客观的发病率测量 [Bittner 1993]。 所有这些参数都在术前和术后 6 个月的随访中进行了评估。 NYHA 和 CCS 等级也记录在 3 个月的临床随访中。
11. 统计分析-功率分析使用 SAS 9.4 TS Level 1M4 软件（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）、POWER Procedure Wilcoxon-Mann-Whitney Test 和固定场景元素 O'Brien-Castelloe 近似法和双侧统计评价。 功率分析样本数据来自之前的开放标签 AAMs 试验 [Nummi 2021]。 总样本量为 50（两组，组大小 25，分布 1:1）时，这些参数在 α 为 0.05 时产生大于 80% 的功效。 组间比较将使用 Mann Whitney U 检验进行。 序数变量使用卡方检验进行检验。 使用 Bonferroni 方法校正多重比较，使用 Mann Whitney U 检验进一步逐组检验重要发现。 生活质量数据以均值形式呈现，并使用独立样本 t 检验（双侧）进行分析。 使用 IBM SPSS Statistics 27 程序（IBM Corp.，Armonk，NY）或等同程序进行分析。 可以在试验期间分阶段分析和发布数据。
12. 术前和术后随访期间的数据收集——临床、实验室和药物治疗数据被收集到医院的电子健康档案中。 出院后和随访期间，患者可以访问初级保健机构。 研究人员收集与手术或他们的心血管系统状况以及药物治疗变化相关的任何访问。 该数据与来自该患者的其他数据一起被假名存储。

13. 数据存储、管理和共享——分析过程中产生的数据存储在HUS和UH的网络硬盘中，也存储在CSC-IT CENTER FOR SCIENCE LTD的服务器上。 （芬兰）专为敏感数据存储而设计，全部带有自动备份功能。 使用相应的假名化密钥和随机化代码直接识别患者数据存储在位于安全医院系统内的密钥注册表中，具有自动备份和访问控制。 对注册表的访问是通过基于角色的访问权限来控制的，只有那些在 HUS 伦理委员会批准的注册表描述中指定的研究人员才能访问其中的数据。 PI 研究员讲师 Pasi Karjalainen 是密钥注册表及其内容的责任方。

    参与者的 TTE 数据通过 IntelliSpace 软件（荷兰飞利浦）访问，该软件最终存储在符合 HUS 数据安全准则的 Microsoft® Azure Cloud 上。 LGE-CMRI 数据和报告存储在数字 HUS 图片存档和通信系统 (PACS) 中。 需要时，LGE-CMRI 数据在 HUS 医学影像中心的服务器之间进行内部传输，以便使用适当的 CMR 软件进行图像分析。 案例报告格式都物理存储在 HUS 场所，具有访问控制，并以电子方式存储在研究登记处。

    研究登记处的加入是通过基于角色的加入权来控制的，只有那些在登记描述文件中单独指定并经 HUS 伦理委员会批准的研究团队成员才能访问其中的数据。 所有工作站、网络驱动器和服务器均受密码保护。

    在与欧盟内部或外部的学术研究合作者共享任何假名数据之前，无论是通过 CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD 进行的。 （芬兰）服务器或由赫尔辛基大学或赫尔辛基大学医院的官方快递员运送的受强密码保护的硬盘驱动器，负责的合作科学家或附属机构的代表将签署材料转移协议（MTA）。 这些 MTA 将使用欧盟委员会的标准合同条款 (SCC) 来保护假名数据的访问，即传输。 此外，所有处理假名数据的人员都必须签署正式的 HUS 保密和数据安全承诺。 此外，CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD。 要求每个合作者在访问假名数据之前签署自己的数据保密处理协议。

    原则上，在试验的活跃阶段之后，生成的假名数据将存储在芬兰 IT 科学中心 CSC (SD-Apply) 的服务器上 15 年 (2040)。 在此之后，数据通过删除所有假名进行匿名处理并无限期地管理。 一个独特的数据访问委员会将监督存储数据的重复使用。 此外，通过上传到欧洲分子生物学实验室欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI，英国剑桥）的欧洲核苷酸档案（ENA）或Gene Expression Omnibus (GEO) 功能基因组学数据库存储库（美国国家生物技术信息中心 NCBI，贝塞斯达，马里兰州，美国）。

14. 试验监测——AAMS2 试验将由临床研究所、赫尔辛基大学中心医院 (HUCH) 或同等监测服务提供商进行外部监测，以确保试验对象的权利、安全和福祉。 在招募任何患者参加研究之前，将与服务提供者和研究小组一起起草一份详细的监测计划。
15. 研究团队——AAMS2 试验是与 HUS 心肺中心（PI 讲师 Pasi Karjalainen 和联合 PI Antti Vento 医学博士）和赫尔辛基大学（讲师 Esko Kankuri 医学博士）合作进行的。 研究护士与 PI 一起监督和组织患者筛查、招募、通知和联系（通过电话或邮件）、围手术期 AAM 处理和控制访问的预约。 此外，研究护士与赫尔辛基大学的科学家合作组织研究样本物流。 随机化在赫尔辛基大学进行。 CABG手术及AAMs补片的应用由HUS心肺中心实施。 LGE-CMRI 成像和分析由 HUS 放射学系和赫尔辛基大学进行。 患者筛查、招募以及术前和术后临床访视（包括 TTE 记录）和临床评估均由 HUS 心肺中心心脏科进行。 心脏麻醉师将记录关键的术后参数。 表观转录组学和其他生物标志物的分析由赫尔辛基大学医学院药理学系组织。