EVOO 与代谢相关脂肪性肝病（MASLD）患者的代谢性肝脏健康 (EvoLiveR)

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球范围内最普遍的非传染性慢性疾病之一，也是肝脏相关死亡和发病的主要原因。 目前，该病影响约38%的全球成年人口以及7%至14%的儿童人口，预测显示其患病率将持续上升，到2040年将超过44%。

MASLD这一术语最近被引入，以取代以往的脂肪性肝病命名（非酒精性脂肪性肝病，NAFLD），并强调“脂肪肝”与代谢综合征之间的密切关系，如2023年多学会德尔菲共识声明所述。

MASLD的定义是在无明显酒精摄入或其他脂肪变性原因的情况下，肝脏中甘油三酯的积累，并伴有以下至少一种心脏代谢风险因素：肥胖、2型糖尿病、血脂异常或动脉高血压。 其病理生理学是多因素的，涉及可改变和不可改变的因素：肝损伤是代谢功能障碍、不健康饮食、体力活动不足和遗传易感性共同作用的结果。

目前，对于MASLD管理的药物治疗尚无强烈共识。 因此，生活方式调整，重点关注饮食和身体活动，仍然是预防和管理MASLD的一线干预措施。 最近的研究将饮食确定为MASLD临床方法中的主要可改变因素，强调了饮食质量和饮食习惯在调节各种代谢过程中的关键作用。 大多数科学证据一致认为，地中海饮食是与健康益处最密切相关的饮食模式，对多种非传染性慢性疾病具有保护作用。

地中海饮食是地中海沿岸国家居民遵循的传统饮食模式。 其益处主要归因于其包含的特征性食物，这些食物富含营养素、抗氧化化合物和膳食纤维。 地中海饮食基于高摄入水果、蔬菜、全谷物、豆类、坚果和特级初榨橄榄油，适量摄入鱼类和禽类，以及低摄入红肉和加工产品。

特级初榨橄榄油（EVOO）是地中海饮食中使用的主要烹饪脂肪。 它由97-99%的甘油三酯和一小部分生物活性成分组成，这些成分负责其生物活性和感官特性。 EVOO的健康效应归因于其高含量的单不饱和脂肪酸（主要是油酸）以及一系列次要但宝贵的成分，如多酚、植物甾醇、生育酚、角鲨烯和酚类化合物，所有这些都以其抗炎和抗氧化作用而闻名。

大量临床和干预研究表明，补充EVOO，尤其是在地中海饮食方案中，可以减少MASLD受试者的肝脏脂肪变性。 其肝脏保护作用与炎症、氧化应激和胰岛素抵抗的改善有关，这些都是MASLD发病机制中的关键机制。 EVOO多酚已被证明可以降低白细胞介素-6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）的水平，从而发挥抗炎作用。 橄榄苦苷是EVOO辛辣味道的化合物，通过抑制环氧合酶-1和-2（COX-1/COX-2）发挥类似布洛芬的作用，进一步减少炎症。

除了抗炎特性外，EVOO还被认为是一种强大的抗氧化剂。 富含EVOO的地中海饮食已被证明可以降低8-羟基-2-脱氧鸟苷（一种已知的氧化DNA损伤标志物）的水平，减少脂质过氧化，降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和髓过氧化物酶水平，并增加肥胖和正常体重成年人的脂联素和白细胞介素-10（IL-10）水平。 几项研究还报道了EVOO的餐后抗氧化活性，与餐后血浆脂质过氧化物水平降低相关。

与EVOO摄入相关的肝功能改善也反映在肝脏酶丙氨酸氨基转移酶（AST）、天冬氨酸氨基转移酶（ALT）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）水平的降低上，这些是肝脏炎症和损伤的重要标志物。 研究报道了持续2至12个月的EVOO补充后肝脏酶水平的降低。

与其代谢益处一致，EVOO的摄入，特别是在地中海饮食背景下，显示出对血糖控制和胰岛素敏感性的显著改善。 研究报道了较低的空腹血糖、胰岛素和HOMA-IR值，表明特级初榨橄榄油有助于改善葡萄糖代谢，这是MASLD的关键组成部分，并与胰岛素抵抗密切相关。

EVOO摄入对血脂谱也有积极影响。 研究证明，低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平降低，以及高密度脂蛋白（HDL）的活性和组成得到改善。

一些作者认为，EVOO对代谢性疾病和整体健康的有益影响可能通过肠道微生物群的变化介导。 在大鼠中，富含EVOO的饮食改变了肠道微生物群谱，增加了其生物多样性，随后改善了胰岛素抵抗和体重等代谢参数。 此外，假设酪醇（EVOO的酚类成分之一）可能通过调节肠道微生物群并通过增加解偶联蛋白1（UCP1）等因子的基因表达触发脂肪组织产热，从而诱导小鼠体重减轻。

包含每日摄入特级初榨橄榄油的饮食也被认为是减重和维持体重的有效选择。 据观察，每日摄入三到四汤匙EVOO的饮食比低脂饮食导致更大的体重减轻。 此外，对于相同的减重量，每日摄入EVOO比每日摄入普通种子油能产生更大的脂肪质量减少。 根据体外和动物研究，这种额外脂肪质量减少的潜在机制归因于EVOO酚类，它们减少脂肪细胞增殖并通过激活棕色脂肪组织增加产热。

目前，欧洲食品安全局（EFSA）指出，特级初榨橄榄油的保护作用可以通过每日至少摄入20克EVOO或5.0毫克羟基酪醇获得。 然而，尚不清楚这些量是否对MASLD个体，特别是超重或肥胖个体同样有效。

本研究将采用干预性设计，包括两个干预组：将从本研究所的“营养临床研究中心用于肥胖和代谢疾病的研究和治疗”招募60名连续患有MASLD且20 ≤ BMI < 30的受试者。

招募将通过全科医生支持，通过自愿参与并利用已进行的队列研究。

干预将是营养性的：两个组的受试者将接受等热量地中海式饮食，根据LARN第5版，考虑年龄、性别和生活方式设计。

符合研究纳入标准的受试者，在筛选访视（V0）期间评估后，将被邀请在前14天内摄入预定义量的EVOO（3汤匙 - 约30克），以减少选择偏倚。

14天结束后，入组受试者将被随机分配到两个干预组。

• 组A：该组受试者将被要求除了饮食中指定的食物外，每日摄入3汤匙（约30克）EVOO，相当于270千卡，包含在规定饮食的总热量中。 油必须在一天中的任何时间生用。
• 组B：该组受试者将被要求除了饮食中指定的食物外，每日摄入9汤匙（约90克）EVOO，相当于810千卡，包含在规定饮食的总热量中。 油必须在一天中的任何时间生用。

治疗将持续约74天，除了V0（筛选访视）外，计划进行3次额外访视：

• V1：V0 + 14天
• V2：饮食交付后30天
• V3：V2 + 30天

在V0，潜在符合条件的受试者在签署知情同意书后，将接受：

• Fibroscan，以评估肝脏脂肪变性程度
• 人体测量特征测量（身高、体重和BMI）

如果符合纳入标准，招募的受试者将被要求摄入预定义量的EVOO（3汤匙 - 约30克），以减少选择偏倚。

招募的受试者将被邀请在14天后（V0 + 14天）返回进行V1，禁食至少12小时，接受Fibroscan以确认纳入标准。

如果纳入标准得到确认，受试者将被纳入研究并接受：

• 病史采集（家族史、生理史、既往和近期病理史及药物史）
• 人体测量特征测量（体重和BMI、腰围和颈围）
• 生物阻抗分析
• DEXA
• 静脉穿刺采血
• 在线饮食问卷

受试者将被要求带来：

• 一份粪便样本
• 一份尿液样本

（注意：如果受试者不再符合纳入标准，生物样本将立即丢弃。）

在V1符合纳入标准的受试者将被随机分配到两个干预组之一。

受试者将通过电子邮件接收由机构营养师准备的等热量饮食。

收到饮食30天后，他们将返回进行V2，禁食至少12小时，接受：

• 人体测量特征测量（体重和BMI、腰围和颈围）
• 生物阻抗分析
• 静脉穿刺采血
• V2后30天，受试者将返回进行最终访视（V3），禁食至少12小时，接受：
• Fibroscan
• 人体测量特征测量（体重和BMI、腰围和颈围）
• 生物阻抗分析
• DEXA
• 静脉穿刺采血

受试者将被要求带来：

• 一份粪便样本
• 一份尿液样本

考虑到研究目标之一是评估EVOO摄入仅对MASLD的影响，有必要确保招募的受试者体重没有显著变化。

因此，参与者将被要求每周报告体重。

在体重发生显著变化的情况下，营养计划将被调整。

获得的全血和血清样本将被送往中心实验室，测量常规及营养、代谢和心血管风险参数（空腹血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、HDL和LDL、转氨酶（AST和ALT）、γGT、肌酐、尿酸、全血细胞计数、铁蛋白、25-羟基维生素D、钙、IGF-I、TSH、FT3、FT4、proBNP）。

根据结果，将计算胰岛素抵抗程度（HOMA指数）和肝脏脂肪变性程度FLI（脂肪肝指数），基于人体测量（BMI、腰围）和生化参数（甘油三酯和γGT），以及肝脏纤维化（FIB-4）。

FIB-4通过关联受试者的年龄、AST水平和血小板计数来确定肝纤维化水平。

FIB-4公式为：（年龄[岁] × AST [U/L]）/（（PLT [10(9)/L]）×（ALT [U/L]^(1/2)））。

FIB-4评分 <1.45对晚期纤维化的阴性预测值为90%，而FIB-4 >3.25对晚期纤维化的特异性为97%，阳性预测值为65%。

还将测量主要脂肪因子（瘦素、脂联素、RBP-4、抵抗素、内脂素、趋化素）、主要肝生长因子（HGF、胎球蛋白A、FGF21、FGF19、PAI-1）、主要促炎细胞因子（高敏C反应蛋白、IL-6、IL-8和TNF-α）和抗炎细胞因子IL-4；其他等分试样将用于脂质组学和生化分析。

脂质组学分析将在招募受试者的红细胞膜上进行。

脂肪酸将被提取、衍生化，并使用配备60米极性毛细管柱和FID检测器的气相色谱仪进行分析。 脂质谱将通过与用作标准的脂肪酸甲酯色谱图进行比较来识别。

在所有访视收集的血清样本中，将通过研究SOD1和SOD2以及酶果糖胺3-激酶和乙二醛酶来评估抗氧化活性、炎症状态和血清去糖化酶水平。

研究中的受试者还将被要求每次访视带来1份粪便样本用于评估肠道微生物群和粪便代谢组，以及1份尿液样本。

为了评估肠道微生物群，将使用QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）从粪便样本中提取总细菌宏基因组DNA。

微生物组表征将使用DNA元条形码和鸟枪宏转录组学方法进行。

DNA元条形码分析将使用细菌16S rRNA的高变V5-V6区域进行（MiSeq-Illumina平台）。

在DNA元条形码分析中显著的样本将进行宏转录组学分析（NextSeq 500 - Illumina平台）。

宏基因组和宏转录组数据将使用生物信息学流程分析。

代谢组学分析将在粪便和尿液样本上进行；样本将分析挥发性有机化合物（VOCs），这些化合物将被热解吸并立即转移到Clarus 680气相色谱仪（Perkin Elmer, Beaconsfield, UK）的加热进样口（220°C），该色谱仪配备Rtx-WAX柱（30 m × 0.25 mm i.d., 0.25 µm膜厚）（Restek）并耦合到Clarus SQ8MS（Perkin Elmer），源和传输线温度分别保持在250和210°C。

可选访视

入组受试者将被询问，完全自愿且不影响参与研究，是否同意接受两次门诊乙状结肠镜检查并进行冷活检。

一次乙状结肠镜检查将在筛选访视后和研究开始前进行；第二次将在治疗结束时进行。

柔性乙状结肠镜检查通过将内窥镜插入直肠并推进到乙状结肠进行。 为了获取小组织样本（1-2毫米），使用冷活检钳。

活检样本将放在干冰上用于研究目的。 结肠黏膜样本的分析不会为参与者或其家庭成员提供额外的临床相关信息。

参与研究的受试者可以拒绝接受乙状结肠镜检查和相关活检。

乙状结肠镜检查和结肠黏膜活检伴随一些风险：

不太可能：

活检出血

柔性乙状结肠镜检查期间使用的空气引起的腹部痉挛

罕见但严重：

结肠穿孔

受试者将收到常规血液检查、Fibroscan、生物阻抗分析、DEXA以及如果进行的乙状结肠镜检查的报告

[1](comet://newtab/)