EVOO och metabol levershälsa vid MASLD (EvoLiveR)

Metabolism-relaterad steatosisk leversjukdom (MASLD) är en av de vanligaste icke-smittsamma kroniska sjukdomarna globalt och den främsta orsaken till leverrelaterad dödlighet och sjuklighet. Den drabbar för närvarande cirka 38 % av den globala vuxna befolkningen och mellan 7 % och 14 % av den pediatriska befolkningen, och prognoser indikerar att dess förekomst kommer att fortsätta att öka och överstiga 44 % till 2040.

Termen MASLD infördes nyligen för att ersätta den tidigare nomenklaturen för steatosisk leversjukdom (icke-alkoholisk fettleversjukdom, NAFLD) och för att betona det nära sambandet mellan ”fettlever” och metabolt syndrom, som rapporterats i den multisamhälleliga Delphi-konsensusrapporten från 2023.

MASLD definieras av ackumulering av triglycerider i levern i avsaknad av betydande alkoholintag eller andra orsaker till steatos, tillsammans med minst en av följande kardiometabola riskfaktorer: fetma, typ 2-diabetes, dyslipidemi eller arteriell hypertoni. Dess patofysiologi är multifaktoriell och involverar både modifierbara och icke-modifierbara faktorer: leverskada uppstår genom den kombinerade effekten av metabol dysfunktion, ohälsosam kost, fysisk inaktivitet och genetisk predisposition.

För närvarande finns ingen stark konsensus kring farmakologisk terapi för behandling av MASLD. Av denna anledning representerar livsstilsförändring, med fokus på kost och fysisk aktivitet, fortfarande det första ingreppet för prevention och behandling av MASLD. Nya studier identifierar kost som en primär modifierbar faktor i den kliniska tillvägagångssättet för MASLD, och lyfter fram kostkvalitetens och matvanornas nyckelroll i att modulera olika metaboliska processer. Den största delen av den vetenskapliga evidensen är överens om att identifiera medelhavskosten som det kostmönster som är starkast associerat med hälsofördelar, med skyddande effekter mot flera icke-smittsamma kroniska sjukdomar.

Medelhavskosten är ett traditionellt kostmönster som följs av befolkningar i länder som gränsar till Medelhavet. Dess fördelar beror främst på de karakteristiska livsmedel den inkluderar, som är rika på näringsämnen, antioxidanter och kostfiber. Medelhavskosten baseras på hög konsumtion av frukt, grönsaker, fullkorn, baljväxter, nötter och extra jungfruolivolja, måttligt intag av fisk och fågel, samt lågt intag av rött kött och bearbetade produkter.

Extra jungfruolivolja (EVOO) är det huvudsakliga matfettet som används i medelhavskosten. Den består av 97–99 % triglycerider och en liten andel bioaktiva komponenter som är ansvariga för dess biologiska aktivitet och organoleptiska egenskaper. EVOO:s hälsoeffekter beror på dess höga innehåll av enkelomättade fettsyror, främst oleinsyra, och på en rad mindre men värdefulla komponenter som polyfenoler, fytosteroler, tokokoferoler, skvalen och fenoliska föreningar, alla kända för sina antiinflammatoriska och antioxidanta effekter.

Många kliniska och interventionsstudier har visat att tillskott av EVOO, särskilt när det ingår i ett medelhavskostregime, kan minska hepatisk steatos hos personer med MASLD. Dess hepatoprotektiva effekt är relaterad till förbättringar av inflammation, oxidativ stress och insulinresistens, vilka alla är nyckelmekanismer i patogenesen av MASLD. EVOO-polyfenoler har visats minska nivåer av interleukin-6 (IL-6) och C-reaktivt protein (CRP), och utövar därmed en antiinflammatorisk effekt. Oleocanthal, föreningen som är ansvarig för den stickande smaken av EVOO, utövar en ibuprofenliknande effekt genom att inhibera cyklooxygenas-1 och -2 (COX-1/COX-2), vilket ytterligare minskar inflammation.

Förutom dess antiinflammatoriska egenskaper är EVOO också erkänt som en kraftfull antioxidant. En medelhavskost berikad med EVOO har visats minska nivåer av 8-hydroxi-2-deoxiguanosin (en känd markör för oxidativ DNA-skada), minska lipidperoxidation, sänka tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) och myeloperoxidasnivåer, samt öka adiponektin- och interleukin-10 (IL-10)-nivåer hos både överviktiga och normalviktiga vuxna. Flera studier har också rapporterat postprandiell antioxidativ aktivitet av EVOO, kopplad till reducerade plasmalipidperoxidnivåer efter måltider.

Förbättrad leverfunktion associerad med EVOO-intag återspeglas också av reducerade nivåer av leverenzymerna alaninaminotransferas (AST), aspartataminotransferas (ALT) och gammaglutamyltransferas (GGT), som är viktiga markörer för leverinflammation och -skada. Studier har rapporterat minskningar i leverenzymnivåer efter EVOO-tillskott som varar i 2 till 12 månader.

Konsistent med dess metabola fördelar har EVOO-konsumtion, särskilt i samband med medelhavskosten, visat signifikanta förbättringar i glykemisk kontroll och insulinkänslighet. Studier har rapporterat lägre fastande glukos, insulin och HOMA-IR-värden, vilket tyder på att extra jungfruolivolja bidrar till förbättrad glukosmetabolism, som är en nyckelkomponent i MASLD och nära kopplad till insulinresistens.

Positiva effekter av EVOO-konsumtion har också observerats på lipidprofilen. Studier har demonstrerat minskningar i LDL-kolesterol och triglyceridnivåer, samt förbättringar i aktiviteten och sammansättningen av högdensitetslipoproteiner (HDL).

Några författare föreslår att de fördelaktiga effekterna av EVOO på metaboliska sjukdomar och hälsa i allmänhet kan medieras genom förändringar i tarmmikrobiotan. Hos ratter modifierade en kost berikad med EVOO tarmmikrobiotaprofilen, ökade dess biodiversitet och förbättrade därefter metaboliska parametrar som insulinresistens och kroppsvikt. Dessutom har det antagits att tyrosol, en av de fenoliska komponenterna i EVOO, kan inducera viktminskning hos möss genom att modulera tarmmikrobiotan och utlösa termogenes i fettvävnad genom ökad genuttryckning av faktorer som okoplande protein 1 (UCP1).

En kost som inkluderar daglig konsumtion av extra jungfruolivolja anses också vara ett giltigt och effektivt alternativ för viktminskning och viktupprätthållande. Det har observerats att kostar som inkluderar tre eller fyra matskedar EVOO per dag leder till större viktminskning än lågfettskostar. Dessutom, för samma mängd viktminskning, kan daglig EVOO-konsumtion ge större minskning av fettmassa jämfört med dagligt intag av generiska fröoljor. Enligt in vitro- och djurstudier är de potentiella mekanismerna bakom denna ytterligare minskning av fettmassa tillskrivbara EVOO-fenoler, som minskar adipocytproliferation och ökar termogenes via aktivering av brunt fettvävnad.

För närvarande konstaterar den europeiska livsmedelsmyndigheten (EFSA) att de skyddande effekterna av extra jungfruolivolja kan erhållas med ett dagligt intag av minst 20 g EVOO eller 5,0 mg hydroxtyrosol. Det är dock fortfarande oklart om dessa mängder är lika effektiva hos individer med MASLD, särskilt de som är överviktiga eller feta.

Den aktuella studien kommer att vara interventionsstudie i design och kommer att inkludera två interventionsarmar: 60 på varandra följande personer med MASLD och med 20 ≤ BMI < 30 kommer att rekryteras från ”Centro di Nutrizione Clinica per la Ricerca e la Cura dell'Obesità e delle Malattie del Metabolismo” vid vårt institut.

Rekrytering kommer att stödjas av allmänläkare, genom frivilligt deltagande och genom att dra på redan pågående kohortstudier.

Interventionen kommer att vara nutritionell: deltagare som rekryterats i båda armarna kommer att få en isokalorisk medelhavskost, utformad med hänsyn till ålder, kön och livsstil, i enlighet med LARN, 5:e revisionen.

Deltagare som uppfyller studiens inklusionskriterier, bedömda under ett screeningsbesök (V0), kommer att inbjudas, under de första 14 dagarna, att konsumera en fördefinierad mängd EVOO (3 matskedar – cirka 30 g), för att minska urvalsbias.

Vid slutet av de 14 dagarna kommer rekryterade deltagare att randomiseras till två interventionsarmar.

• Grupp A: Deltagare i denna grupp kommer att ombedjas att konsumera, förutom de livsmedel som anges i kosten, 3 matskedar (cirka 30 g) EVOO per dag, motsvarande 270 kcal, inkluderade i de totala kalorierna i den föreskrivna kosten. Oljan måste användas rå när som helst på dagen.
• Grupp B: Deltagare i denna grupp kommer att ombedjas att konsumera, förutom de livsmedel som anges i kosten, 9 matskedar (cirka 90 g) EVOO per dag, motsvarande 810 kcal, inkluderade i de totala kalorierna i den föreskrivna kosten. Oljan måste användas rå när som helst på dagen.

Behandlingen kommer att pågå i cirka 74 dagar och, förutom V0 (screeningsbesök), är ytterligare 3 besök planerade:

• V1: V0 + 14 dagar
• V2: 30 dagar efter dietleverans
• V3: V2 + 30 dagar

Vid V0 kommer potentiellt berättigade deltagare, efter att ha undertecknat informerat samtyckesformulär, att genomgå:

• Fibroscan, för att bedöma graden av hepatisk steatos
• Mätning av antropometriska egenskaper (längd, vikt och BMI)

Om inklusionskriterierna uppfylls kommer rekryterade deltagare att ombedjas att konsumera en fördefinierad mängd EVOO (3 matskedar – cirka 30 g), för att minska urvalsbias.

Rekryterade deltagare kommer att inbjudas att återvända för V1 efter 14 dagar (V0 + 14 dagar), fastande i minst 12 timmar, för att genomgå en Fibroscan för att bekräfta inklusionskriterier.

Om inklusionskriterierna bekräftas kommer deltagare att rekryteras till studien och kommer att genomgå:

• Medicinsk anamnes (familje, fysiologisk, tidigare och senare patologisk, och farmakologisk)
• Mätning av antropometriska egenskaper (vikt och BMI, midjeomkrets och halsomkrets)
• Bioimpedansanalys
• DEXA
• Blodprovstagning genom venpunktion
• Online kostfrågeformulär

Deltagare kommer att ombedjas att ta med:

• Ett avföringsprov
• Ett urinprov

(OBS: Om deltagaren inte längre uppfyller inklusionskriterierna kommer de biologiska proverna att kasseras omedelbart.)

Deltagare som uppfyller inklusionskriterierna vid V1 kommer att randomiseras till en av de två interventionsarmarna.

Deltagare kommer att få den isokaloriska kosten via e-post, utarbetad av institutionens dietist.

Efter 30 dagar från mottagandet av kosten kommer de att återvända för V2 där de, fastande i minst 12 timmar, kommer att genomgå:

• Mätning av antropometriska egenskaper (vikt och BMI, midjeomkrets och halsomkrets)
• Bioimpedansanalys
• Blodprovstagning genom venpunktion
• Efter 30 dagar från V2 kommer deltagare att återvända för det slutliga besöket (V3) där de, fastande i minst 12 timmar, kommer att genomgå:
• Fibroscan
• Mätning av antropometriska egenskaper (vikt och BMI, midjeomkrets och halsomkrets)
• Bioimpedansanalys
• DEXA
• Blodprovstagning genom venpunktion

Deltagare kommer att ombedjas att ta med:

• Ett avföringsprov
• Ett urinprov

Med tanke på att ett av studiens mål är att utvärdera effekten av EVOO-konsumtion uteslutande på MASLD, är det nödvändigt att det inte finns några signifikanta viktförändringar hos de rekryterade deltagarna.

Därför kommer deltagare att ombedjas att rapportera sin kroppsvikt varje vecka.

I händelse av signifikant viktvariation kommer näringsplanen att justeras.

Helblod- och serumprover som erhållits kommer att skickas till centrallaboratoriet för mätning av rutin- och nutritionella, metaboliska och kardiovaskulära riskparametrar (fastande glukos, insulin, glykerat hemoglobin, triglycerider, total kolesterol, HDL och LDL, transaminaser (AST och ALT), γGT, kreatinin, urinsyra, fullständigt blodstatus, ferritin, 25-OH-vitamin D, kalcium, IGF-I, TSH, FT3, FT4, proBNP).

På basis av resultaten kommer graden av insulinresistens (HOMA-index) och graden av hepatisk steatos FLI (fettleverindex), baserat på antropometriska (BMI, midjeomkrets) och biokemiska parametrar (triglycerider och γGT), och hepatisk fibros (FIB-4), att beräknas.

FIB-4 möjliggör att nivån av leverfibros fastställs genom att relatera deltagarens ålder, AST-nivåer och trombocytantal.

FIB-4-formeln är: (Ålder [år] × AST [U/L]) / ((PLT [10(9)/L]) × (ALT [U/L]^(1/2))).

Ett FIB-4-poäng <1,45 har ett negativt prediktivt värde på 90 % för avancerad fibros, medan ett FIB-4 >3,25 har en specificitet på 97 % och ett positivt prediktivt värde på 65 % för avancerad fibros.

De huvudsakliga adipokinerna (leptin, adiponektin, RBP-4, resistin, visfatin, chemerin), de största hepatiska tillväxtfaktorerna (HGF, Fetuin-A, FGF21, FGF19, PAI-1), de huvudsakliga proinflammatoriska cytokinerna (högkänsligt C-reaktivt protein, IL-6, IL-8 och TNF-α) och den antiinflammatoriska cytokinen IL-4 kommer också att mätas; andra aliquot kommer att användas för lipidomiska och biokemiska analyser.

Lipidomisk analys kommer att utföras på de rekryterade deltagarnas röda blodkroppsmembran.

Fettsyror kommer att extraheras, deriveras och analyseras med en gaskromatograf utrustad med en 60 m polar kapillärkolonn och en FID-detektor. Lipidprofiler kommer att identifieras genom att jämföra dem med kromatogram av fettsyrametylester som används som standarder.

I serumprover insamlade vid alla besök kommer antioxidativ aktivitet, inflammatorisk status och serumhalter av deglykerande enzymer att bedömas genom att studera SOD1 och SOD2, och enzymerna Fruktosamin 3-Kinas och glyoxalas.

Deltagare i studien kommer också att ombedjas att ta med, vid varje besök, 1 avföringsprov för bedömning av tarmmikrobiota och fekal metabolom, och 1 urinprov.

För bedömning av tarmmikrobiotan kommer totalt bakterielt metagenomiskt DNA att extraheras från avföringsprover med QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Mikrobiomkarakterisering kommer att utföras med en DNA-metabarcoding och shotgun-metatranskriptomisk metod.

DNA-metabarcoding-analys kommer att utföras med de hypervariabla V5-V6-regionerna av 16S rRNA för bakterier (MiSeq-Illumina-plattform).

Prover som är signifikanta vid DNA-metabarcoding-analys kommer att genomgå metatranskriptomisk analys (NextSeq 500 - Illumina-plattform).

Metagenomiska och metatranskriptomiska data kommer att analyseras med bioinformatiska pipelines.

Metabolomiska analyser kommer att utföras på avförings- och urinprover; prover kommer att analyseras för flyktiga organiska föreningar (VOCs), som kommer att termiskt desorberas och omedelbart överföras till den uppvärmda injektionsporten (220 °C) på en Clarus 680 gaskromatograf (Perkin Elmer, Beaconsfield, Storbritannien) utrustad med en Rtx-WAX-kolonn (30 m × 0,25 mm i.d., 0,25 µm filmtjocklek) (Restek) och kopplad till en Clarus SQ8MS (Perkin Elmer), med källa och överföringslinjetemperaturer som hålls vid 250 respektive 210 °C.

Valfria besök

Rekryterade deltagare kommer att ombedjas, på ett helt frivilligt och valfritt sätt som inte påverkar deltagandet i studien, om de samtycker till att genomgå två ambulanta sigmoidoskopier med kalla biopsier.

En sigmoidoskopi kommer att utföras efter screeningsbesöket och innan studiens start; den andra kommer att utföras vid behandlingens slut.

Flexibel sigmoidoskopi utförs genom att föra in en endoskop i rektum och förflytta den in i sigmoidkolon. För att erhålla små vävnadsprover (1–2 mm) används kalla biopsifångare.

Biopsiprover kommer att placeras på torris för forskningsändamål. Analyser av kolonslemhinneprover kommer inte att ge ytterligare kliniskt relevant information för deltagare eller deras familjemedlemmar.

Deltagare som rekryterats till studien kan vägra att genomgå sigmoidoskopi och de relaterade biopsierna.

Sigmoidoskopi och kolonslemhinnebiopsier är associerade med vissa risker:

Mindre sannolikt:

Blödning från biopsier

Abdominella kramper på grund av luften som används under flexibel sigmoidoskopi

Sällsynta men allvarliga:

Kolonperforation

Deltagare kommer att få rapporter om rutinblodprov, Fibroscan, bioimpedansanalys, DEXA och, om utförd, sigmoidoskopi

[1](comet://newtab/)