Azeite Virgem Extra e Saúde Metabólica do Fígado na MASLD (EvoLiveR)

A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) é uma das doenças crónicas não transmissíveis mais difundidas em todo o mundo e a principal causa de mortalidade e morbilidade relacionadas com o fígado. Atualmente afeta cerca de 38% da população adulta global e entre 7% e 14% da população pediátrica, e as projeções indicam que a sua prevalência continuará a aumentar, ultrapassando 44% até 2040.

O termo MASLD foi introduzido recentemente para substituir a antiga nomenclatura da doença hepática esteatótica (doença hepática gordurosa não alcoólica, NAFLD) e para enfatizar a relação estreita entre o "fígado gorduroso" e a síndrome metabólica, conforme relatado na declaração de consenso Delphi de 2023 de múltiplas sociedades.

A MASLD é definida pela acumulação de triglicerídeos no fígado na ausência de ingestão significativa de álcool ou outras causas de esteatose, juntamente com pelo menos um dos seguintes fatores de risco cardiometabólicos: obesidade, diabetes mellitus tipo 2, dislipidemia ou hipertensão arterial. A sua fisiopatologia é multifatorial e envolve fatores modificáveis e não modificáveis: o dano hepático resulta do efeito combinado da disfunção metabólica, dieta pouco saudável, inatividade física e predisposição genética.

Atualmente, não existe um consenso forte sobre a terapia farmacológica para o tratamento da MASLD. Por esta razão, a modificação do estilo de vida, com foco na dieta e na atividade física, ainda representa a intervenção de primeira linha para a prevenção e gestão da MASLD. Estudos recentes identificam a dieta como um fator modificável primário na abordagem clínica da MASLD, destacando o papel fundamental da qualidade da dieta e dos hábitos alimentares na modulação de vários processos metabólicos. A maior parte das evidências científicas concorda em identificar a dieta mediterrânica como o padrão alimentar mais fortemente associado a benefícios para a saúde, com efeitos protetores contra várias doenças crónicas não transmissíveis.

A dieta mediterrânica é um padrão alimentar tradicional seguido pelas populações que vivem em países banhados pelo Mar Mediterrâneo. Os seus benefícios são principalmente atribuíveis aos alimentos característicos que inclui, que são ricos em nutrientes, compostos antioxidantes e fibra alimentar. A dieta mediterrânica baseia-se no elevado consumo de frutas, vegetais, cereais integrais, leguminosas, frutos secos e azeite virgem extra, ingestão moderada de peixe e aves, e baixa ingestão de carne vermelha e produtos processados.

O azeite virgem extra (EVOO) é a principal gordura culinária utilizada na dieta mediterrânica. É composto por 97-99% de triglicerídeos e uma pequena fração de componentes bioativos responsáveis pela sua atividade biológica e propriedades organoléticas. Os efeitos na saúde do EVOO devem-se ao seu elevado teor de ácidos gordos monoinsaturados, principalmente ácido oleico, e a uma série de componentes menores mas valiosos, como polifenóis, fitoesteróis, tocoferóis, esqualeno e compostos fenólicos, todos conhecidos pelos seus efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes.

Numerosos estudos clínicos e intervencionais mostraram que a suplementação com EVOO, especialmente quando incluída num regime de dieta mediterrânica, pode reduzir a esteatose hepática em indivíduos com MASLD. O seu efeito hepatoprotetor está relacionado com melhorias na inflamação, stress oxidativo e resistência à insulina, que são todos mecanismos-chave na patogénese da MASLD. Demonstrou-se que os polifenóis do EVOO reduzem os níveis de interleucina-6 (IL-6) e proteína C-reativa (PCR), exercendo assim um efeito anti-inflamatório. O oleocantal, o composto responsável pelo sabor picante do EVOO, exerce uma ação semelhante ao ibuprofeno, inibindo a ciclo-oxigenase-1 e -2 (COX-1/COX-2), reduzindo ainda mais a inflamação.

Além das suas propriedades anti-inflamatórias, o EVOO também é reconhecido como um poderoso antioxidante. Demonstrou-se que uma dieta mediterrânica enriquecida com EVOO reduz os níveis de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (um marcador conhecido de dano oxidativo do ADN), diminui a peroxidação lipídica, reduz os níveis de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e mieloperoxidase, e aumenta os níveis de adiponectina e interleucina-10 (IL-10) tanto em adultos obesos como com peso normal. Vários estudos também relataram atividade antioxidante pós-prandial do EVOO, ligada à redução dos níveis de peróxidos lipídicos plasmáticos após as refeições.

A melhoria da função hepática associada à ingestão de EVOO também se reflete na redução dos níveis das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (AST), aspartato aminotransferase (ALT) e gama-glutamil transferase (GGT), que são marcadores importantes de inflamação e dano hepático. Estudos relataram reduções nos níveis de enzimas hepáticas após suplementação com EVOO com duração de 2 a 12 meses.

Consistente com os seus benefícios metabólicos, o consumo de EVOO, particularmente no contexto da dieta mediterrânica, mostrou melhorias significativas no controlo glicémico e na sensibilidade à insulina. Estudos relataram valores mais baixos de glicose em jejum, insulina e HOMA-IR, sugerindo que o azeite virgem extra contribui para a melhoria do metabolismo da glucose, que é um componente-chave da MASLD e está intimamente ligado à resistência à insulina.

Também foram observados efeitos positivos do consumo de EVOO no perfil lipídico. Estudos demonstraram reduções nos níveis de colesterol LDL e triglicerídeos, bem como melhorias na atividade e composição das lipoproteínas de alta densidade (HDL).

Alguns autores sugerem que os efeitos benéficos do EVOO nas doenças metabólicas e na saúde em geral podem ser mediados por alterações na microbiota intestinal. Em ratos, uma dieta enriquecida com EVOO modificou o perfil da microbiota intestinal, aumentando a sua biodiversidade e melhorando subsequentemente parâmetros metabólicos como a resistência à insulina e o peso corporal. Além disso, foi hipotetizado que o tirosol, um dos componentes fenólicos do EVOO, pode induzir perda de peso em ratos, modulando a microbiota intestinal e desencadeando termogénese do tecido adiposo através do aumento da expressão génica de fatores como a proteína desacopladora 1 (UCP1).

Uma dieta que inclui o consumo diário de azeite virgem extra também é considerada uma opção válida e eficaz para perda de peso e manutenção do peso. Observou-se que dietas que incluem três ou quatro colheres de sopa de EVOO por dia levam a uma maior redução de peso do que dietas com baixo teor de gordura. Além disso, para a mesma quantidade de perda de peso, o consumo diário de EVOO pode produzir uma maior redução da massa gorda em comparação com a ingestão diária de óleos de sementes genéricos. De acordo com estudos in vitro e em animais, os potenciais mecanismos subjacentes a esta redução adicional da massa gorda são atribuíveis aos fenóis do EVOO, que diminuem a proliferação de adipócitos e aumentam a termogénese através da ativação do tecido adiposo castanho.

Atualmente, a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA) afirma que os efeitos protetores do azeite virgem extra podem ser obtidos com uma ingestão diária de pelo menos 20 g de EVOO ou 5,0 mg de hidroxitirosol. No entanto, ainda não está claro se estas quantidades são igualmente eficazes em indivíduos com MASLD, particularmente naqueles com excesso de peso ou obesidade.

O estudo em questão será de design intervencionista e incluirá dois braços de intervenção: 60 indivíduos consecutivos com MASLD e com IMC entre 20 e <30 serão recrutados no "Centro di Nutrizione Clinica per la Ricerca e la Cura dell'Obesità e delle Malattie del Metabolismo" do nosso Instituto.

O recrutamento será apoiado por médicos de família, através de participação voluntária e recorrendo a estudos de coorte já em curso.

A intervenção será nutricional: os sujeitos inscritos em ambos os braços receberão uma dieta isocalórica de estilo mediterrânico, projetada tendo em conta a idade, o sexo e o estilo de vida, de acordo com os LARN, 5ª Revisão.

Aos sujeitos que cumprirem os critérios de inclusão do estudo, avaliados durante uma Visita de Rastreio (V0), será solicitado, durante os primeiros 14 dias, que consumam uma quantidade pré-definida de EVOO (3 colheres de sopa - aproximadamente 30 g), a fim de reduzir o viés de seleção.

No final dos 14 dias, os sujeitos inscritos serão randomizados em dois braços de intervenção.

• Grupo A: Os sujeitos inscritos neste grupo serão solicitados a consumir, além dos alimentos indicados na dieta, 3 colheres de sopa (aproximadamente 30 g) de EVOO por dia, correspondendo a 270 kcal, incluídas nas calorias totais da dieta prescrita. O azeite deve ser usado cru a qualquer hora do dia.
• Grupo B: Os sujeitos inscritos neste grupo serão solicitados a consumir, além dos alimentos indicados na dieta, 9 colheres de sopa (aproximadamente 90 g) de EVOO por dia, correspondendo a 810 kcal, incluídas nas calorias totais da dieta prescrita. O azeite deve ser usado cru a qualquer hora do dia.

O tratamento terá uma duração de aproximadamente 74 dias e, além da V0 (Visita de Rastreio), estão planeadas mais 3 visitas:

• V1: V0 + 14 dias
• V2: 30 dias após entrega da dieta
• V3: V2 + 30 dias

Na V0, os sujeitos potencialmente elegíveis, após assinarem o formulário de consentimento informado, serão submetidos a:

• Fibroscan, para avaliar o grau de esteatose hepática
• Medição das características antropométricas (altura, peso e IMC)

Se os critérios de inclusão forem cumpridos, será solicitado aos sujeitos recrutados que consumam uma quantidade pré-definida de EVOO (3 colheres de sopa - aproximadamente 30 g), a fim de reduzir o viés de seleção.

Os sujeitos recrutados serão convidados a regressar para a V1 após 14 dias (V0 + 14 dias), em jejum de pelo menos 12 horas, para realizar um Fibroscan para confirmar os critérios de inclusão.

Se os critérios de inclusão forem confirmados, os sujeitos serão inscritos no estudo e serão submetidos a:

• História clínica (familiar, fisiológica, patológica passada e recente, e farmacológica)
• Medição das características antropométricas (peso e IMC, perímetro da cintura e perímetro do pescoço)
• Análise de bioimpedância
• DEXA
• Colheita de sangue por venopunção
• Questionário dietético online

Será solicitado aos sujeitos que tragam:

• Uma amostra de fezes
• Uma amostra de urina

(N.B.: Se o sujeito deixar de cumprir os critérios de inclusão, as amostras biológicas serão imediatamente descartadas.)

Os sujeitos que cumprirem os critérios de inclusão na V1 serão randomizados para um dos dois braços de intervenção.

Os sujeitos receberão a dieta isocalórica por e-mail, preparada pela Dietista da Instituição.

Após 30 dias da receção da dieta, regressarão para a V2 onde, em jejum de pelo menos 12 horas, serão submetidos a:

• Medição das características antropométricas (peso e IMC, perímetro da cintura e perímetro do pescoço)
• Análise de bioimpedância
• Colheita de sangue por venopunção
• Após 30 dias da V2, os sujeitos regressarão para a visita final (V3) onde, em jejum de pelo menos 12 horas, serão submetidos a:
• Fibroscan
• Medição das características antropométricas (peso e IMC, perímetro da cintura e perímetro do pescoço)
• Análise de bioimpedância
• DEXA
• Colheita de sangue por venopunção

Será solicitado aos sujeitos que tragam:

• Uma amostra de fezes
• Uma amostra de urina

Considerando que um dos objetivos do estudo é avaliar o efeito do consumo de EVOO exclusivamente na MASLD, é necessário que não haja alterações significativas de peso nos sujeitos recrutados.

Portanto, será solicitado aos participantes que relatem o seu peso corporal semanalmente.

No caso de variação significativa de peso, o plano nutricional será ajustado.

As amostras de sangue total e soro obtidas serão enviadas para o laboratório central para medição de parâmetros de rotina e de risco nutricional, metabólico e cardiovascular (glicemia em jejum, insulina, hemoglobina glicada, triglicerídeos, colesterol total, HDL e LDL, transaminases (AST e ALT), γGT, creatinina, ácido úrico, hemograma completo, ferritina, 25-OH-vitamina D, cálcio, IGF-I, TSH, FT3, FT4, proBNP).

Com base nos resultados, serão calculados o grau de resistência à insulina (índice HOMA) e o grau de esteatose hepática FLI (índice de fígado gorduroso), com base em parâmetros antropométricos (IMC, perímetro da cintura) e bioquímicos (triglicerídeos e γGT), e fibrose hepática (FIB-4).

O FIB-4 permite estabelecer o nível de fibrose hepática relacionando a idade do sujeito, os níveis de AST e a contagem de plaquetas.

A fórmula do FIB-4 é: (Idade [anos] × AST [U/L]) / ((PLT [10(9)/L]) × (ALT [U/L]^(1/2))).

Um valor de FIB-4 <1,45 tem um valor preditivo negativo de 90% para fibrose avançada, enquanto um FIB-4 >3,25 tem uma especificidade de 97% e um valor preditivo positivo de 65% para fibrose avançada.

Também serão medidos as principais adipocinas (leptina, adiponectina, RBP-4, resistina, visfatina, quemerina), os principais fatores de crescimento hepático (HGF, Fetuin-A, FGF21, FGF19, PAI-1), as principais citocinas pró-inflamatórias (proteína C-reativa de alta sensibilidade, IL-6, IL-8 e TNF-α) e a citocina anti-inflamatória IL-4; outras alíquotas serão usadas para análises lipidómicas e bioquímicas.

A análise lipidómica será realizada nas membranas dos eritrócitos dos sujeitos recrutados.

Os ácidos gordos serão extraídos, derivatizados e analisados com um cromatógrafo a gás equipado com uma coluna capilar polar de 60 m e um detetor FID. Os perfis lipídicos serão identificados comparando-os com cromatogramas de ésteres metílicos de ácidos gordos usados como padrões.

Nas amostras de soro recolhidas em todas as visitas, a atividade antioxidante, o estado inflamatório e os níveis séricos de enzimas desglicantes serão avaliados através do estudo da SOD1 e SOD2, e das enzimas Frutosamina 3-Quinase e glicoxalase.

Também será solicitado aos sujeitos do estudo que tragam, em cada visita, 1 amostra de fezes para avaliação da microbiota intestinal e do metaboloma fecal, e 1 amostra de urina.

Para avaliação da microbiota intestinal, o ADN metagenómico bacteriano total será extraído das amostras de fezes usando o QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha).

A caracterização do microbioma será realizada usando uma abordagem de metabarcoding de ADN e metatranscriptómica shotgun.

A análise de metabarcoding de ADN será conduzida usando as regiões hipervariáveis V5-V6 do 16S rRNA para bactérias (plataforma MiSeq-Illumina).

Amostras significativas na análise de metabarcoding de ADN serão submetidas a análise metatranscriptómica (NextSeq 500 - plataforma Illumina).

Os dados metagenómicos e metatranscriptómicos serão analisados usando pipelines bioinformáticos.

Análises metabolómicas serão realizadas em amostras de fezes e urina; as amostras serão analisadas para compostos orgânicos voláteis (VOCs), que serão termicamente desorvidos e imediatamente transferidos para a porta de injeção aquecida (220 °C) de um cromatógrafo a gás Clarus 680 (Perkin Elmer, Beaconsfield, Reino Unido) equipado com uma coluna Rtx-WAX (30 m × 0,25 mm i.d., espessura do filme 0,25 µm) (Restek) e acoplado a um Clarus SQ8MS (Perkin Elmer), com temperaturas da fonte e da linha de transferência mantidas a 250 e 210 °C, respetivamente.

Visitas opcionais

Aos sujeitos inscritos será perguntado, de forma completamente opcional e voluntária, que não afeta a participação no estudo, se concordam em realizar duas sigmoidoscopias ambulatórias com biópsias a frio.

Uma sigmoidoscopia será realizada após a visita de rastreio e antes do início do estudo; a segunda será realizada no final do tratamento.

A sigmoidoscopia flexível é realizada passando um endoscópio no reto e avançando-o para o cólon sigmoide. Para obter pequenas amostras de tecido (1-2 mm), são usadas pinças de biópsia a frio.

As amostras de biópsia serão colocadas em gelo seco para fins de investigação. As análises das amostras da mucosa do cólon não fornecerão informações clinicamente relevantes adicionais para os participantes ou seus familiares.

Os sujeitos inscritos no estudo podem recusar-se a realizar a sigmoidoscopia e as biópsias relacionadas.

A sigmoidoscopia e as biópsias da mucosa do cólon estão associadas a alguns riscos:

Menos prováveis:

Sangramento das biópsias

Cólicas abdominais devido ao ar usado durante a sigmoidoscopia flexível

Raros mas graves:

Perfuração do cólon

Os sujeitos receberão os relatórios dos exames de sangue de rotina, Fibroscan, análise de bioimpedância, DEXA e, se realizadas, sigmoidoscopia

[1](comet://newtab/)