EVOO e Salute Metabolica del Fegato nella MASLD (EvoLiveR)

La malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è una delle malattie croniche non trasmissibili più diffuse a livello mondiale e la principale causa di mortalità e morbilità epatica. Attualmente colpisce circa il 38% della popolazione adulta globale e tra il 7% e il 14% della popolazione pediatrica, e le proiezioni indicano che la sua prevalenza continuerà a salire, superando il 44% entro il 2040.

Il termine MASLD è stato recentemente introdotto per sostituire la precedente nomenclatura per la malattia epatica steatosica (malattia del fegato grasso non alcolica, NAFLD) e per enfatizzare la stretta relazione tra "fegato grasso" e sindrome metabolica, come riportato nella dichiarazione di consenso Delphi multisocietaria del 2023.

La MASLD è definita dall'accumulo di trigliceridi nel fegato in assenza di un consumo significativo di alcol o di altre cause di steatosi, insieme ad almeno uno dei seguenti fattori di rischio cardiometabolico: obesità, diabete mellito di tipo 2, dislipidemia o ipertensione arteriosa. La sua patogenesi è multifattoriale e coinvolge sia fattori modificabili che non modificabili: il danno epatico risulta dall'effetto combinato della disfunzione metabolica, di una dieta non salutare, dell'inattività fisica e della predisposizione genetica.

Al momento, non esiste un forte consenso sulla terapia farmacologica per la gestione della MASLD. Per questo motivo, la modifica dello stile di vita, con un focus su dieta e attività fisica, rappresenta ancora l'intervento di prima linea per la prevenzione e la gestione della MASLD. Studi recenti identificano la dieta come un fattore modificabile primario nell'approccio clinico alla MASLD, evidenziando il ruolo chiave della qualità della dieta e delle abitudini alimentari nel modulare vari processi metabolici. La maggior parte delle evidenze scientifiche concorda nell'identificare la dieta mediterranea come il modello alimentare più fortemente associato a benefici per la salute, con effetti protettivi contro diverse malattie croniche non trasmissibili.

La dieta mediterranea è un modello alimentare tradizionale seguito dalle popolazioni che vivono nei paesi che si affacciano sul Mar Mediterraneo. I suoi benefici sono principalmente attribuibili agli alimenti caratteristici che include, ricchi di nutrienti, composti antiossidanti e fibra alimentare. La dieta mediterranea si basa su un elevato consumo di frutta, verdura, cereali integrali, legumi, noci e olio extravergine di oliva, un consumo moderato di pesce e pollame e un basso consumo di carne rossa e prodotti lavorati.

L'olio extravergine di oliva (EVOO) è il principale grasso culinario utilizzato nella dieta mediterranea. È composto per il 97-99% da trigliceridi e da una piccola frazione di componenti bioattivi responsabili della sua attività biologica e delle proprietà organolettiche. Gli effetti sulla salute dell'EVOO sono dovuti al suo alto contenuto di acidi grassi monoinsaturi, principalmente acido oleico, e a una serie di componenti minori ma preziosi come polifenoli, fitosteroli, tocoferoli, squalene e composti fenolici, tutti noti per i loro effetti antinfiammatori e antiossidanti.

Numerosi studi clinici e interventistici hanno dimostrato che l'integrazione con EVOO, specialmente se inclusa in un regime di dieta mediterranea, può ridurre la steatosi epatica in soggetti con MASLD. Il suo effetto epatoprotettivo è correlato a miglioramenti nell'infiammazione, nello stress ossidativo e nella resistenza insulinica, che sono tutti meccanismi chiave nella patogenesi della MASLD. I polifenoli dell'EVOO hanno dimostrato di ridurre i livelli di interleuchina-6 (IL-6) e proteina C-reattiva (CRP), esercitando così un effetto antinfiammatorio. L'oleocantale, il composto responsabile del gusto piccante dell'EVOO, esercita un'azione simile all'ibuprofene inibendo la cicloossigenasi-1 e -2 (COX-1/COX-2), riducendo ulteriormente l'infiammazione.

Oltre alle sue proprietà antinfiammatorie, l'EVOO è anche riconosciuto come un potente antiossidante. Una dieta mediterranea arricchita con EVOO ha dimostrato di ridurre i livelli di 8-idrossi-2-deossiguanosina (un noto marcatore del danno ossidativo al DNA), diminuire la perossidazione lipidica, abbassare i livelli del fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) e della mieloperossidasi, e aumentare i livelli di adiponectina e interleuchina-10 (IL-10) sia in adulti obesi che normopeso. Diversi studi hanno anche riportato un'attività antiossidante postprandiale dell'EVOO, legata a ridotti livelli di perossidi lipidici plasmatici dopo i pasti.

Il miglioramento della funzionalità epatica associato all'assunzione di EVOO si riflette anche nella riduzione dei livelli degli enzimi epatici alanina aminotransferasi (AST), aspartato aminotransferasi (ALT) e gamma-glutamil transferasi (GGT), che sono importanti marcatori di infiammazione e danno epatico. Studi hanno riportato riduzioni nei livelli degli enzimi epatici seguenti integrazione con EVOO della durata da 2 a 12 mesi.

Coerenti con i suoi benefici metabolici, il consumo di EVOO, in particolare nel contesto della dieta mediterranea, ha mostrato miglioramenti significativi nel controllo glicemico e nella sensibilità insulinica. Studi hanno riportato valori più bassi di glicemia a digiuno, insulina e HOMA-IR, suggerendo che l'olio extravergine di oliva contribuisce a migliorare il metabolismo del glucosio, che è una componente chiave della MASLD e strettamente legata alla resistenza insulinica.

Effetti positivi del consumo di EVOO sono stati osservati anche sul profilo lipidico. Studi hanno dimostrato riduzioni nei livelli di colesterolo LDL e trigliceridi, nonché miglioramenti nell'attività e nella composizione delle lipoproteine ad alta densità (HDL).

Alcuni autori suggeriscono che gli effetti benefici dell'EVOO sulle malattie metaboliche e sulla salute in generale possano essere mediati da cambiamenti nel microbiota intestinale. Nei ratti, una dieta arricchita con EVOO ha modificato il profilo del microbiota intestinale, aumentandone la biodiversità e successivamente migliorando parametri metabolici come la resistenza insulinica e il peso corporeo. Inoltre, è stato ipotizzato che il tirosolo, uno dei componenti fenolici dell'EVOO, possa indurre perdita di peso nei topi modulando il microbiota intestinale e innescando la termogenesi del tessuto adiposo attraverso l'aumentata espressione genica di fattori come la proteina disaccoppiante 1 (UCP1).

Una dieta che include il consumo giornaliero di olio extravergine di oliva è anche considerata un'opzione valida ed efficace per la perdita di peso e il mantenimento del peso. È stato osservato che diete che includono tre o quattro cucchiai di EVOO al giorno portano a una maggiore riduzione del peso rispetto a diete a basso contenuto di grassi. Inoltre, per la stessa quantità di perdita di peso, il consumo giornaliero di EVOO può produrre una maggiore riduzione della massa grassa rispetto all'assunzione giornaliera di oli vegetali generici. Secondo studi in vitro e su animali, i potenziali meccanismi alla base di questa ulteriore riduzione della massa grassa sono attribuibili ai fenoli dell'EVOO, che diminuiscono la proliferazione degli adipociti e aumentano la termogenesi tramite l'attivazione del tessuto adiposo bruno.

Attualmente, l'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA) afferma che gli effetti protettivi dell'olio extravergine di oliva possono essere ottenuti con un'assunzione giornaliera di almeno 20 g di EVOO o 5,0 mg di idrossitirosolo. Tuttavia, non è ancora chiaro se queste quantità siano ugualmente efficaci negli individui con MASLD, in particolare in quelli sovrappeso o obesi.

Lo studio in questione sarà di disegno interventistico e includerà due bracci di intervento: 60 soggetti consecutivi con MASLD e con 20 ≤ BMI < 30 saranno reclutati dal "Centro di Nutrizione Clinica per la Ricerca e la Cura dell'Obesità e delle Malattie del Metabolismo" del nostro Istituto.

Il reclutamento sarà supportato dai medici di medicina generale, tramite partecipazione volontaria e attingendo a studi di coorte già in corso.

L'intervento sarà nutrizionale: i soggetti arruolati in entrambi i bracci riceveranno una dieta isocalorica di tipo mediterraneo, progettata tenendo conto di età, sesso e stile di vita, in conformità con i LARN, 5ª Revisione.

I soggetti che soddisfano i criteri di inclusione dello studio, valutati durante una Visita di Screening (V0), saranno invitati, per i primi 14 giorni, a consumare una quantità predeterminata di EVOO (3 cucchiai - circa 30 g), al fine di ridurre il bias di selezione.

Alla fine dei 14 giorni, i soggetti arruolati saranno randomizzati in due bracci di intervento.

• Gruppo A: I soggetti arruolati in questo gruppo saranno invitati a consumare, oltre agli alimenti indicati nella dieta, 3 cucchiai (circa 30 g) di EVOO al giorno, corrispondenti a 270 kcal, incluse nelle calorie totali della dieta prescritta. L'olio deve essere utilizzato crudo in qualsiasi momento della giornata.
• Gruppo B: I soggetti arruolati in questo gruppo saranno invitati a consumare, oltre agli alimenti indicati nella dieta, 9 cucchiai (circa 90 g) di EVOO al giorno, corrispondenti a 810 kcal, incluse nelle calorie totali della dieta prescritta. L'olio deve essere utilizzato crudo in qualsiasi momento della giornata.

Il trattamento durerà circa 74 giorni e, oltre a V0 (Visita di Screening), sono previste 3 ulteriori visite:

• V1: V0 + 14 giorni
• V2: 30 giorni dopo la consegna della dieta
• V3: V2 + 30 giorni

Alla V0, i soggetti potenzialmente idonei, dopo aver firmato il modulo di consenso informato, si sottoporranno a:

• Fibroscan, per valutare il grado di steatosi epatica
• Misurazione delle caratteristiche antropometriche (altezza, peso e BMI)

Se i criteri di inclusione sono soddisfatti, ai soggetti reclutati sarà chiesto di consumare una quantità predeterminata di EVOO (3 cucchiai - circa 30 g), al fine di ridurre il bias di selezione.

I soggetti reclutati saranno invitati a tornare per la V1 dopo 14 giorni (V0 + 14 giorni), a digiuno da almeno 12 ore, per sottoporsi a un Fibroscan per confermare i criteri di inclusione.

Se i criteri di inclusione sono confermati, i soggetti saranno arruolati nello studio e si sottoporranno a:

• Anamnesi (familiare, fisiologica, patologica passata e recente, e farmacologica)
• Misurazione delle caratteristiche antropometriche (peso e BMI, circonferenza vita e circonferenza collo)
• Analisi bioimpedenziometrica
• DEXA
• Prelievo di sangue per venipuntura
• Questionario dietetico online

Ai soggetti sarà chiesto di portare:

• Un campione di feci
• Un campione di urina

(N.B.: Se il soggetto non soddisfa più i criteri di inclusione, i campioni biologici saranno immediatamente scartati.)

I soggetti che soddisfano i criteri di inclusione alla V1 saranno randomizzati a uno dei due bracci di intervento.

I soggetti riceveranno la dieta isocalorica via email, preparata dal Dietista dell'Istituzione.

Dopo 30 giorni dal ricevimento della dieta, torneranno per la V2 dove, a digiuno da almeno 12 ore, si sottoporranno a:

• Misurazione delle caratteristiche antropometriche (peso e BMI, circonferenza vita e circonferenza collo)
• Analisi bioimpedenziometrica
• Prelievo di sangue per venipuntura
• Dopo 30 giorni dalla V2, i soggetti torneranno per la visita finale (V3) dove, a digiuno da almeno 12 ore, si sottoporranno a:
• Fibroscan
• Misurazione delle caratteristiche antropometriche (peso e BMI, circonferenza vita e circonferenza collo)
• Analisi bioimpedenziometrica
• DEXA
• Prelievo di sangue per venipuntura

Ai soggetti sarà chiesto di portare:

• Un campione di feci
• Un campione di urina

Considerando che uno degli obiettivi dello studio è valutare l'effetto del consumo di EVOO esclusivamente sulla MASLD, è necessario che non ci siano cambiamenti di peso significativi nei soggetti reclutati.

Pertanto, ai partecipanti sarà chiesto di riportare il proprio peso corporeo settimanalmente.

In caso di variazione di peso significativa, il piano nutrizionale sarà adeguato.

I campioni di sangue intero e siero ottenuti saranno inviati al laboratorio centrale per la misurazione dei parametri di routine e di rischio nutrizionale, metabolico e cardiovascolare (glicemia a digiuno, insulina, emoglobina glicata, trigliceridi, colesterolo totale, HDL e LDL, transaminasi (AST e ALT), γGT, creatinina, acido urico, emocromo completo, ferritina, 25-OH-vitamina D, calcio, IGF-I, TSH, FT3, FT4, proBNP).

Sulla base dei risultati, saranno calcolati il grado di resistenza insulinica (indice HOMA) e il grado di steatosi epatica FLI (indice di fegato grasso), basato su parametri antropometrici (BMI, circonferenza vita) e biochimici (trigliceridi e γGT), e fibrosi epatica (FIB-4).

Il FIB-4 consente di stabilire il livello di fibrosi epatica mettendo in relazione l'età del soggetto, i livelli di AST e la conta piastrinica.

La formula del FIB-4 è: (Età [anni] × AST [U/L]) / ((PLT [10(9)/L]) × (ALT [U/L]^(1/2))).

Un punteggio FIB-4 <1,45 ha un valore predittivo negativo del 90% per fibrosi avanzata, mentre un FIB-4 >3,25 ha una specificità del 97% e un valore predittivo positivo del 65% per fibrosi avanzata.

Saranno anche misurate le principali adipochine (leptina, adiponectina, RBP-4, resistina, visfatina, chemerina), i principali fattori di crescita epatici (HGF, Fetuin-A, FGF21, FGF19, PAI-1), le principali citochine pro-infiammatorie (proteina C-reattiva ad alta sensibilità, IL-6, IL-8 e TNF-α) e la citochina anti-infiammatoria IL-4; altre aliquote saranno utilizzate per analisi lipidomiche e biochimiche.

L'analisi lipidomica sarà eseguita sulle membrane degli eritrociti dei soggetti reclutati.

Gli acidi grassi saranno estratti, derivatizzati e analizzati con un gas cromatografo dotato di una colonna capillare polare da 60 m e un rivelatore FID. I profili lipidici saranno identificati confrontandoli con cromatogrammi di esteri metilici degli acidi grassi utilizzati come standard.

Nei campioni di siero raccolti a tutte le visite, saranno valutati l'attività antiossidante, lo stato infiammatorio e i livelli sierici degli enzimi deglicanti studiando SOD1 e SOD2, e gli enzimi Fruttosamina 3-Chinasi e gliossalasi.

Ai soggetti dello studio sarà anche chiesto di portare, ad ogni visita, 1 campione di feci per la valutazione del microbiota intestinale e del metaboloma fecale, e 1 campione di urina.

Per la valutazione del microbiota intestinale, il DNA metagenomico batterico totale sarà estratto dai campioni di feci utilizzando il QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania).

La caratterizzazione del microbioma sarà effettuata utilizzando un approccio di metabarcoding del DNA e metatranscriptomica shotgun.

L'analisi di metabarcoding del DNA sarà condotta utilizzando le regioni ipervariabili V5-V6 dell'rRNA 16S per i batteri (piattaforma MiSeq-Illumina).

I campioni significativi nell'analisi di metabarcoding del DNA saranno sottoposti ad analisi metatranscriptomica (NextSeq 500 - piattaforma Illumina).

I dati metagenomici e metatranscriptomici saranno analizzati utilizzando pipeline bioinformatiche.

Le analisi metabolomiche saranno eseguite su campioni di feci e urina; i campioni saranno analizzati per composti organici volatili (VOCs), che saranno termicamente desorbiti e immediatamente trasferiti al portainiezione riscaldato (220 °C) di un gas cromatografo Clarus 680 (Perkin Elmer, Beaconsfield, UK) dotato di una colonna Rtx-WAX (30 m × 0,25 mm i.d., spessore film 0,25 µm) (Restek) e accoppiato a un Clarus SQ8MS (Perkin Elmer), con temperature della sorgente e della linea di trasferimento mantenute rispettivamente a 250 e 210 °C.

Visite opzionali

Ai soggetti arruolati sarà chiesto, su base completamente opzionale e volontaria che non influisce sulla partecipazione allo studio, se accettano di sottoporsi a due sigmoidoscopie ambulatoriali con biopsie a freddo.

Una sigmoidoscopia sarà eseguita dopo la visita di screening e prima dell'inizio dello studio; la seconda sarà eseguita alla fine del trattamento.

La sigmoidoscopia flessibile viene eseguita facendo passare un endoscopio nel retto e avanzandolo nel colon sigmoideo. Per ottenere piccoli campioni di tessuto (1-2 mm), vengono utilizzate pinze da biopsia a freddo.

I campioni di biopsia saranno posti su ghiaccio secco per scopi di ricerca. Le analisi dei campioni di mucosa del colon non forniranno ulteriori informazioni clinicamente rilevanti per i partecipanti o i loro familiari.

I soggetti arruolati nello studio possono rifiutarsi di sottoporsi alla sigmoidoscopia e alle relative biopsie.

La sigmoidoscopia e le biopsie della mucosa del colon sono associate ad alcuni rischi:

Meno probabili:

Sanguinamento dalle biopsie

Crampi addominali dovuti all'aria utilizzata durante la sigmoidoscopia flessibile

Rari ma gravi:

Perforazione del colon

I soggetti riceveranno i referti degli esami del sangue di routine, del Fibroscan, dell'analisi bioimpedenziometrica, della DEXA e, se eseguita, della sigmoidoscopia

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