EVOO og Metabol Leverhelbred i MASLD (EvoLiveR)

Metabolisk dysfunktions-associeret steatotisk leversygdom (MASLD) er en af de mest udbredte ikke-smittende kroniske sygdomme i verden og den førende årsag til leverrelateret dødelighed og morbiditet. Den rammer i øjeblikket omkring 38% af den voksne verdensbefolkning og mellem 7% og 14% af den pædiatriske befolkning, og fremskrivninger indikerer, at dens prævalens vil fortsætte med at stige og overstige 44% inden 2040.

Begrebet MASLD blev for nylig introduceret for at erstatte den tidligere nomenklatur for steatotisk leversygdom (ikke-alkoholisk fedtlever, NAFLD) og for at understrege det tætte forhold mellem "fedtlever" og metabolisk syndrom, som rapporteret i 2023 års multiselskabs Delphi-konsensuserklæring.

MASLD defineres ved akkumulering af triglycerider i leveren i fravær af signifikant alkoholindtag eller andre årsager til steatose, sammen med mindst en af følgende kardiometaboliske risikofaktorer: fedme, type 2-diabetes, dyslipidæmi eller arteriel hypertension. Dens patofysiologi er multifaktoriel og involverer både modificerbare og ikke-modificerbare faktorer: leverskade er resultatet af den kombinerede effekt af metabolisk dysfunktion, usund kost, fysisk inaktivitet og genetisk prædisposition.

I øjeblikket er der ingen stærk konsensus om farmakologisk terapi til behandling af MASLD. Af denne grund er livsstilsændring, med fokus på kost og fysisk aktivitet, stadig den første interventionslinje til forebyggelse og behandling af MASLD. Nylige studier identificerer kost som en primær modificerbar faktor i den kliniske tilgang til MASLD og fremhæver den afgørende rolle af kostkvalitet og spisevaner i modulering af forskellige metaboliske processer. Det meste af den videnskabelige evidens er enige om at identificere Middelhavskosten som det kostmønster, der er stærkest associeret med sundhedsfordele, med beskyttende effekter mod flere ikke-smittende kroniske sygdomme.

Middelhavskosten er et traditionelt kostmønster fulgt af befolkninger, der lever i lande omkring Middelhavet. Dens fordele kan hovedsageligt tilskrives de karakteristiske fødevarer, den inkluderer, som er rige på næringsstoffer, antioxidanter og kostfibre. Middelhavskosten er baseret på højt forbrug af frugt, grøntsager, fuldkorn, bælgfrugter, nødder og ekstra jomfru olivenolie, moderat indtag af fisk og fjerkræ og lavt indtag af rødt kød og forarbejdede produkter.

Ekstra jomfru olivenolie (EVOO) er det primære kulinariske fedtstof, der bruges i Middelhavskosten. Den består af 97-99% triglycerider og en lille fraktion af bioaktive komponenter, der er ansvarlige for dens biologiske aktivitet og organoleptiske egenskaber. EVOO's sundhedseffekter skyldes dens høje indhold af monoumættede fedtsyrer, primært olieinsyre, og en række mindre, men værdifulde komponenter såsom polyfenoler, fytosteroler, tokopheroler, squalen og fenoliske forbindelser, alle kendt for deres antiinflammatoriske og antioxidative effekter.

Adskillige kliniske og interventionsstudier har vist, at EVOO-tilskud, især når inkluderet i et Middelhavskostregime, kan reducere hepatisk steatose hos personer med MASLD. Dens hepatoprotektive effekt er relateret til forbedringer i inflammation, oxidativ stress og insulinresistens, som alle er nøglemekanismer i patogenesen af MASLD. EVOO-polyfenoler har vist sig at reducere niveauer af interleukin-6 (IL-6) og C-reaktivt protein (CRP), og udøver derved en antiinflammatorisk effekt. Oleocanthal, forbindelsen ansvarlig for EVOO's skarpe smag, udøver en ibuprofen-lignende virkning ved at hæmme cyklooxygenase-1 og -2 (COX-1/COX-2), hvilket yderligere reducerer inflammation.

Ud over dens antiinflammatoriske egenskaber er EVOO også anerkendt som et kraftfuldt antioxidant. En Middelhavskost beriget med EVOO har vist sig at reducere niveauer af 8-hydroxy-2-deoxyguanosin (en kendt markør for oxidativ DNA-skade), mindske lipidperoxidation, sænke tumor nekrosefaktor-α (TNF-α) og myeloperoxidase-niveauer og øge adiponektin og interleukin-10 (IL-10) niveauer hos både overvægtige og normalvægtige voksne. Flere studier har også rapporteret postprandial antioxidantaktivitet af EVOO, forbundet med reducerede plasma lipidperoxidniveauer efter måltider.

Forbedret leverfunktion associeret med EVOO-indtag afspejles også ved reducerede niveauer af leverenzymerne alaninaminotransferase (AST), aspartataminotransferase (ALT) og gamma-glutamyltransferase (GGT), som er vigtige markører for leverinflammation og -skade. Studier har rapporteret reduktioner i leverenzymniveauer efter EVOO-tilskud, der varer 2 til 12 måneder.

Overensstemmende med dens metaboliske fordele har EVOO-forbrug, især i forbindelse med Middelhavskosten, vist signifikante forbedringer i glykæmisk kontrol og insulinsensitivitet. Studier har rapporteret lavere fastende glukose, insulin og HOMA-IR-værdier, hvilket tyder på, at ekstra jomfru olivenolie bidrager til forbedret glukosemetabolisme, som er en nøglekomponent i MASLD og tæt forbundet med insulinresistens.

Positive effekter af EVOO-forbrug er også observeret på lipidprofilen. Studier har demonstreret reduktioner i LDL-kolesterol og triglyceridniveauer samt forbedringer i aktiviteten og sammensætningen af højdensitetslipoproteiner (HDL).

Nogle forfattere foreslår, at de gavnlige effekter af EVOO på metaboliske sygdomme og sundhed generelt kan være medieret af ændringer i tarmmikrobiotaen. Hos rotter modificerede en diæt beriget med EVOO tarmmikrobiotaens profil, øgede dens biodiversitet og forbedrede efterfølgende metaboliske parametre såsom insulinresistens og kropsvægt. Derudover er det blevet hypotetiseret, at tyrosol, en af de fenoliske komponenter i EVOO, kan inducere vægttab hos mus ved at modulere tarmmikrobiotaen og udløse termogenese i fedtvæv gennem øget genudtryk af faktorer såsom uncoupling protein 1 (UCP1).

En diæt, der inkluderer dagligt forbrug af ekstra jomfru olivenolie, betragtes også som et gyldigt og effektivt valg til vægttab og vægtvedligeholdelse. Det er blevet observeret, at diæter, der inkluderer tre eller fire spiseskefulde EVOO om dagen, fører til større vægtreduktion end fedtfattige diæter. Desuden kan dagligt EVOO-forbrug, for samme mængde vægttab, producere større reduktion i fedtmasse sammenlignet med dagligt indtag af generiske frøolier. Ifølge in vitro- og dyrestudier kan de potentielle mekanismer, der ligger til grund for denne yderligere reduktion i fedtmasse, tilskrives EVOO-fenoler, der mindsker adipocytproliferation og øger termogenese via aktivering af brunt fedtvæv.

I øjeblikket angiver Den Europæiske Fødevarekontrol (EFSA), at de beskyttende effekter af ekstra jomfru olivenolie kan opnås med et dagligt indtag på mindst 20 g EVOO eller 5,0 mg hydroxytyrosol. Det er dog stadig uklart, om disse mængder er lige effektive hos personer med MASLD, især dem, der er overvægtige eller fede.

Det pågældende studie vil være interventionsdesign og vil inkludere to interventionsarme: 60 konsekutive personer med MASLD og med 20 ≤ BMI < 30 vil blive rekrutteret fra "Centro di Nutrizione Clinica per la Ricerca e la Cura dell'Obesità e delle Malattie del Metabolismo" på vores institut.

Rekruttering vil blive støttet af praktiserende læger gennem frivillig deltagelse og ved at trække på allerede igangværende kohortestudier.

Interventionen vil være ernæringsmæssig: personer indskrevet i begge arme vil modtage en isokalorisk Middelhavskostinspireret diæt, designet under hensyntagen til alder, køn og livsstil i overensstemmelse med LARN, 5. revision.

Personer, der opfylder studiet inklusionskriterierne, vurderet under et screeningsbesøg (V0), vil blive inviteret til at indtage en foruddefineret mængde EVOO (3 spiseskefulde - ca. 30 g) i de første 14 dage for at reducere selectionsbias.

Efter de 14 dage vil indskrevne personer blive randomiseret til to interventionsarme.

• Gruppe A: Personer indskrevet i denne gruppe vil blive bedt om at indtage, ud over de fødevarer angivet i diæten, 3 spiseskefulde (ca. 30 g) EVOO om dagen, svarende til 270 kcal, inkluderet i de totale kalorier i den ordinerede diæt. Oliet skal bruges rå til enhver tid af dagen.
• Gruppe B: Personer indskrevet i denne gruppe vil blive bedt om at indtage, ud over de fødevarer angivet i diæten, 9 spiseskefulde (ca. 90 g) EVOO om dagen, svarende til 810 kcal, inkluderet i de totale kalorier i den ordinerede diæt. Oliet skal bruges rå til enhver tid af dagen.

Behandlingen vil vare ca. 74 dage, og udover V0 (Screeningsbesøg) er der planlagt 3 yderligere besøg:

• V1: V0 + 14 dage
• V2: 30 dage efter udleveringen af diæten
• V3: V2 + 30 dage

Ved V0 vil potentielt kvalificerede personer, efter underskrift af informeret samtykkeformular, gennemgå:

• Fibroscan for at vurdere graden af hepatisk steatose
• Måling af antropometriske karakteristika (højde, vægt og BMI)

Hvis inklusionskriterierne er opfyldt, vil rekrutterede personer blive bedt om at indtage en foruddefineret mængde EVOO (3 spiseskefulde - ca. 30 g) for at reducere selectionsbias.

Rekrutterede personer vil blive inviteret til at vende tilbage til V1 efter 14 dage (V0 + 14 dage), fastende i mindst 12 timer, for at gennemgå en Fibroscan for at bekræfte inklusionskriterier.

Hvis inklusionskriterierne bekræftes, vil personer blive indskrevet i studiet og vil gennemgå:

• Medicinsk historie (familie-, fysiologisk, tidligere og nylig patologisk og farmakologisk)
• Måling af antropometriske karakteristika (vægt og BMI, taljeomkreds og halsomkreds)
• Bioimpedansanalyse
• DEXA
• Blodprøvetagning ved venepunktur
• Online kostspørgeskema

Personer vil blive bedt om at medbringe:

• En afføringsprøve
• En urinprøve

(Bemærk: Hvis personen ikke længere opfylder inklusionskriterierne, vil de biologiske prøver blive øjeblikkeligt destrueret.)

Personer, der opfylder inklusionskriterierne ved V1, vil blive randomiseret til en af de to interventionsarme.

Personer vil modtage den isokaloriske diæt via e-mail, udarbejdet af instituttets diætist.

Efter 30 dage fra modtagelsen af diæten vil de vende tilbage til V2, hvor de fastende i mindst 12 timer vil gennemgå:

• Måling af antropometriske karakteristika (vægt og BMI, taljeomkreds og halsomkreds)
• Bioimpedansanalyse
• Blodprøvetagning ved venepunktur
• Efter 30 dage fra V2 vil personer vende tilbage til det endelige besøg (V3), hvor de fastende i mindst 12 timer vil gennemgå:
• Fibroscan
• Måling af antropometriske karakteristika (vægt og BMI, taljeomkreds og halsomkreds)
• Bioimpedansanalyse
• DEXA
• Blodprøvetagning ved venepunktur

Personer vil blive bedt om at medbringe:

• En afføringsprøve
• En urinprøve

I betragtning af at et af studiet mål er at evaluere effekten af EVOO-forbrug udelukkende på MASLD, er det nødvendigt, at der ikke er signifikante vægtændringer hos de rekrutterede personer.

Derfor vil deltagerne blive bedt om at rapportere deres kropsvægt ugentligt.

I tilfælde af signifikant vægtvariation vil ernæringsplanen blive justeret.

Hele blod- og serumprøver opnået vil blive sendt til central laboratoriet for måling af rutinemæssige og ernæringsmæssige, metaboliske og kardiovaskulære risikoparametre (fastende glukose, insulin, glykeret hemoglobin, triglycerider, total kolesterol, HDL og LDL, transaminaser (AST og ALT), γGT, kreatinin, urinsyre, fuldt blodtal, ferritin, 25-OH-vitamin D, calcium, IGF-I, TSH, FT3, FT4, proBNP).

På baggrund af resultaterne vil graden af insulinresistens (HOMA-indeks) og graden af hepatisk steatose FLI (fedtleverindeks), baseret på antropometriske (BMI, taljeomkreds) og biokemiske parametre (triglycerider og γGT), og hepatisk fibrose (FIB-4), blive beregnet.

FIB-4 gør det muligt at fastslå niveauet af leverfibrose ved at relatere personens alder, AST-niveauer og trombocyttal.

FIB-4 formlen er: (Alder [år] × AST [U/L]) / ((PLT [10(9)/L]) × (ALT [U/L]^(1/2))).

En FIB-4 score <1,45 har en negativ prædiktiv værdi på 90% for avanceret fibrose, hvorimod en FIB-4 >3,25 har en specificitet på 97% og en positiv prædiktiv værdi på 65% for avanceret fibrose.

De vigtigste adipokiner (leptin, adiponektin, RBP-4, resistin, visfatin, chemerin), de vigtigste levertilvækstfaktorer (HGF, Fetuin-A, FGF21, FGF19, PAI-1), de vigtigste proinflammatoriske cytokiner (højfølsomt C-reaktivt protein, IL-6, IL-8 og TNF-α) og det antiinflammatoriske cytokin IL-4 vil også blive målt; andre aliquoter vil blive brugt til lipidomiske og biokemiske analyser.

Lipidomisk analyse vil blive udført på de rekrutterede personers røde blodcellemembraner.

Fedtsyrer vil blive ekstraheret, derivatiseret og analyseret med en gaskromatograf udstyret med en 60 m polar kapillarkolonne og en FID-detektor. Lipidprofiler vil blive identificeret ved at sammenligne dem med kromatogrammer af fedtsyremethylestere brugt som standarder.

I serumprøver indsamlet ved alle besøg vil antioxidantaktivitet, inflammatorisk status og serumniveauer af deglykerende enzymer blive vurderet ved at studere SOD1 og SOD2, og enzymerne Fruktosamin 3-Kinase og glyoxalase.

Personer i studiet vil også blive bedt om at medbringe ved hvert besøg 1 afføringsprøve til vurdering af tarmmikrobiota og fekal metabolom og 1 urinprøve.

Til vurdering af tarmmikrobiotaen vil total bakteriell metagenomisk DNA blive ekstraheret fra afføringsprøver ved hjælp af QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Mikrobiotakarakterisering vil blive udført ved hjælp af en DNA-metabarcoding og shotgun-metatranskriptomisk tilgang.

DNA-metabarcoding-analyse vil blive udført ved hjælp af de hypervariable V5-V6 regioner af 16S rRNA for bakterier (MiSeq-Illumina-platform).

Prøver, der er signifikante på DNA-metabarcoding-analyse, vil gennemgå metatranskriptomisk analyse (NextSeq 500 - Illumina-platform).

Metagenomiske og metatranskriptomiske data vil blive analyseret ved hjælp af bioinformatiske pipelines.

Metabolomiske analyser vil blive udført på afførings- og urinprøver; prøver vil blive analyseret for flygtige organiske forbindelser (VOCs), som vil blive termisk desorberet og straks overført til den opvarmede injektionsport (220 °C) på en Clarus 680 gaskromatograf (Perkin Elmer, Beaconsfield, UK) udstyret med en Rtx-WAX-kolonne (30 m × 0,25 mm i.d., 0,25 µm filmtykkelse) (Restek) og koblet til en Clarus SQ8MS (Perkin Elmer), med kilde- og overførselslinjetemperaturer holdt ved henholdsvis 250 og 210 °C.

Valgfrie besøg

Indskrevne personer vil blive spurgt, på en helt valgfri og frivillig basis, der ikke påvirker deltagelse i studiet, om de er enige i at gennemgå to ambulante sigmoidoskopier med kolde biopsier.

En sigmoidoskopi vil blive udført efter screeningsbesøget og før studiestart; den anden vil blive udført efter behandlingsafslutning.

Fleksibel sigmoidoskopi udføres ved at føre et endoskop ind i rektum og føre det frem i sigmoidcolon. For at opnå små vævsprøver (1-2 mm) bruges kolde biopsitang.

Biopsiprøver vil blive placeret på tørris til forskningsformål. Analyser af colon slimhindeprøver vil ikke give yderligere klinisk relevante oplysninger for deltagere eller deres familiemedlemmer.

Personer indskrevet i studiet kan nægte at gennemgå sigmoidoskopi og de relaterede biopsier.

Sigmoidoskopi og colon slimhindebiopsier er forbundet med nogle risici:

Mindre sandsynlige:

Blødning fra biopsier

Abdominale kramper på grund af luften brugt under fleksibel sigmoidoskopi

Sjældne, men alvorlige:

Colon perforation

Personer vil modtage rapporterne af rutineblodprøver, Fibroscan, bioimpedansanalyse, DEXA og, hvis udført, sigmoidoskopi

[1](comet://newtab/)