Orální pach a parametry související s onemocněním parodontu

V literatuře existuje diskuse o tom, zda je parodontitida spojena se zápachem z úst, a tato studie se pokouší porozumět způsobu, jakým je onemocnění parodontu spojeno s parametry souvisejícími se zápachem z úst.

Klinický protokol:

Sedmdesát osm systémově zdravých nekuřáků bylo vyšetřeno na orální halitózu na katedře parodontologie, Aristotelova univerzita v Soluni, Řecko. Jednalo se o subjekty, které si nestěžovaly na halitózu. Po počátečním screeningu na vhodnost a získání podepsaného informovaného souhlasu schváleného Etickou komisí zubní školy Aristotelovy univerzity v Soluni byl zaznamenán parodontální diagram plných úst včetně indexu plaku (PI), hloubky klinického sondování (CPD), klinického připojení. úrovně (CAL) a krvácení při sondování (BOP) na šesti místech na zub za použití manuální periodontální sondy (Hu-Friedy XP-23/QW). Subjekty, které splnily kritéria klinického zařazení, byly klasifikovány jako chronická parodontitida (N=28), chronická generalizovaná gingivitida (N=23) nebo zdraví jedinci (27) a byli dále klinicky a mikrobiologicky sledováni.

Hodnocení povlaku jazyka:

Winkelův index povlaku jazyka (Winkel et al., 2003) byl stanoven vizuálně rozdělením hřbetu jazyka na sextanty. Skóre mezi nulou a dvěma bylo přiděleno každému sextantu podle množství vkladů a tato skóre se sečetla, takže celkový počet se pohyboval od nuly do 12.

Sbírka vzorku jazyka:

Ze zadní části hřbetu jazyka byl odebrán vzorek pro kvantitativní analýzu dvou domnělých periodontálních patogenů, Porphyromonas gingivalis a Fusobacterium nucleatum, pomocí PCR v reálném čase.

Aby se zabránilo interferenci krvácení při sondování a odběru vzorků z jazyka s organoleptickými hodnoceními a především s hodnocením pachu jazyka, byli jedinci odvoláni při druhé návštěvě ve stejnou denní dobu a během čtyř dnů kvůli zápachu z úst. Posouzení. Během tohoto krátkého časového intervalu byli účastníci požádáni, aby neměnili své rutinní stravovací návyky a návyky ústní hygieny s výjimkou 48 hodin před další návštěvou, kdy se provádělo hodnocení halitózy (Roldán a kol., 2003; Donaldson a kol., 2007). . Každý účastník dostal písemné pokyny ohledně konzumace jídla a pití a návyků ústní hygieny. Podrobněji se 48 před vyšetřením vyhýbaly kořeněným jídlům, cibuli, česneku, alkoholu a ústním vodám. Ráno při hodnocení se vyhýbaly kávě, mentolům, žvýkačkám, praktikám ústní hygieny, vonné kosmetice nebo vodě po holení. Konzumace vody a ústní výplachy vodou byly povoleny alespoň dvě hodiny před hodnocením zápachu. Podobným způsobem se rozhodčí, který prováděl organoleptická hodnocení zápachu z úst, řídil stejnými pokyny jako účastníci po dobu 24 hodin před provedením zkoušek.

Hodnocení zápachu z úst:

• Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) byl použit k měření koncentrace těkavých sulfidových sloučenin (VSC) v částech na miliardu (p.p.b.) (Rosenberg et al., 1991). Hodnocení byla prováděna vždy mezi 10:00-12:00 na stejném stomatologickém křesle na klinice, aby se minimalizovala denní variabilita teploty a vlhkosti v místnosti (Liu et al., 2006);
• Organoleptická hodnocení (ORG) v rozsahu od nuly do pěti (Rosenberg et al., 1991) hodnotila zápach následujících parametrů:

Celý vzduch v ústech (ORG1) - subjekty byly požádány, aby jemně vydechly do 20 cm dlouhé trubice přes síto, aby se vyhnuly očnímu kontaktu s posuzovatelem pachu, který vyhodnotil pach dechu na druhém konci trubice (Murata et al., 2002) ; Přední oblast hřbetu jazyka (ORG2) - subjekty byly požádány, aby si olízly zápěstí a počkaly několik sekund, aby oblast oschla, než byl vyhodnocen zápach; Zadní oblast jazyka (ORG3) - materiál byl odebrán ze zadní části lingválního dorza standardizovaným způsobem pomocí plastové lžičky; Nosní vzduch - subjekty byly požádány, aby vydechly jednou nosní dírkou poté, co si ucpaly druhou nosní dírku prstem, aby se vyloučily mimoorální příčiny, které mohou souviset se zápachem z úst.

Kalibrovaný jediný „vyšetřovatel“ zaznamenával periodontální měření a hodnoty Halimeter®, zatímco jeden kalibrovaný „soudce“ prováděl organoleptické hodnocení halitózy. Všichni účastníci byli hodnoceni stejným zkoušejícím a rozhodčím. Aby bylo zajištěno nestranné shromažďování dat, byl posuzovatel zápachu zaslepen, pokud jde o měření Halimeter® a klinický stav jedince. Před tímto šetřením a během něj byli posuzovatel pachů a další „vyhodnocovač“ pachů opakovaně standardizováni vůči široké škále roztoků n-butanolu s intenzitami od 25 do 6075 ppm (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) a také na zápach z úst pacientů navštěvujících parodontologickou ambulanci. Aby bylo možné posoudit spolehlivost hodnocení porotce, posuzovatel a hodnotitel zkoumali zápach z úst řady účastníků studie, aniž by si vzájemně uvědomovali své skóre. Mezi skóre byla nalezena statisticky významná korelace (Spearmanovo rho=0,64 pro zápach vzduchu v celých ústech, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Je třeba poznamenat, že při analýze dat byla použita pouze hodnocení soudce.

Subjekty byly označeny jako pozitivní na halitózu (+), když buď organoleptické skóre celého vzduchu v ústech bylo dvě nebo více, a/nebo hodnoty Halimeter® přesáhly 140 p.p.b.

Polymerázová řetězová reakce v reálném čase:

DNA P. gingivalis kmene W50 a F. nucleatum kmene ATCC 10953 byla připravena na Dental School, University of Glasgow podle standardního protokolu. Stručně, P. gingivalis a F. nucleatum byly pěstovány na náročném anaerobním agaru a sklizeny po třech až sedmi dnech. Organismy z jediné agarové plotny byly sklizeny tampony a dispergovány v PBS obsahujícím 0,1 mM disodnou sůl EDTA (PBSE). Po jednom promytí v PBS byly resuspendovány v 1 ml sterilní deionizované vody a rozděleny na alikvoty do dvou 1,5 ml mikrouzávěrů se šroubovacím uzávěrem. DNA byla z organismů extrahována umístěním zkumavek na deset minut do vroucí vodní lázně. Lyzát byl míchán se stejným objemem směsi fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1; v/v/v) po dobu pěti minut. Po odstředění (13 000 ot./min, 10 minut) byla vodná horní fáze z každého přípravku přenesena do nové zkumavky a smíchána s jedním objemem směsi chloroform:isoamylalkohol (24:1) po dobu pěti minut. Po odstředění (13 000 ot./min., 10 minut) byla vodná horní fáze z každého přípravku přenesena do nové zkumavky a bylo přidáno 0,1 objemu 4,5M roztoku octanu sodného (pH 5,4) a dva objemy ethanolu. DNA byla precipitována přes noc při -20 °C. DNA byla peletována centrifugací (13 000 ot./min., 10 minut), postupně promyta 1 ml 70% ethanolu, 95% ethanolu a ponechána téměř uschnout. DNA pak byla rozpuštěna ve 100 ul vody. Koncentrace a čistota nukleové kyseliny byla měřena při vlnové délce 260 nanometrů a poměr absorbance při 260 a 280 nanometrech byl měřen pomocí sterilní křemenné kyvety ve spektrofotometru.

Pro kvantitativní analýzu 16S rRNA F. nucleatum a P. gingivalis v povlaku jazyka byl v této studii použit test PCR v reálném čase pomocí systému TaqMan (Yoshida et al., 2003). Lyzáty vzorků byly připraveny vařením alikvotu po dobu 10 minut po propíchnutí uzávěru jemnou sterilní jehlou, aby se zabránilo nárůstu tlaku. PCR byla provedena v celkovém objemu 20 μl pomocí soupravy Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Německo), 500 nM každého ze sense a antisense primerů, 200 nM sondy a 5 μl lyžovaných buněk. Použité druhově specifické primery a TaqMan sondy jsou uvedeny v tabulce 1. Specifičnost amplifikovaných produktů a tedy primerů byla potvrzena dříve (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). Amplifikace a detekce byly provedeny pomocí systému LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Německo) s následujícími podmínkami cyklu, identickými pro oba testy: 95 °C po dobu 10 minut a poté 45 cyklů 95 °C po dobu 10 sekund, 58 °C po dobu 25 sekund a konečné prodloužení při 40 °C po dobu 30 sekund. Pro každý test byla vynesena standardní křivka za použití sériových ředění známých množství purifikované genomové DNA každého testovaného organismu.

Statistické metody:

Statistická nulová hypotéza, že neexistuje žádná souvislost mezi detekcí halitózy (přítomností nebo nepřítomností) a periodontálním stavem u nekuřáků, byla testována logistickou regresí. Vzhledem k tomu, že velikost každé klinické skupiny byla vyšší než 20 a minimální počet pacientů pozitivních na halitózu na klinickou skupinu přesáhl deset, s výjimkou zdravé skupiny (devět pacientů pozitivních na halitózu), velikost vzorku byla považována za adekvátní pro aplikaci této statistiky. model (Peduzzi et al. 1996).

Asociace mezi přítomností nebo nepřítomností halitózy a klinickými indexy (PI, CPD, CAL, BOP, místa > 5 mm CPD, WTCI) byla zkoumána pomocí logistické regrese. Spearmanův rho korelační koeficient odhadl souvislost mezi proměnnými stupnice a také shodu mezi skóre dvou hodnotitelů pachu. Předpoklad normality pro škálové proměnné byl testován Shapiro Wilk testem. Srovnání mezi skupinami bylo provedeno pomocí Kruskal-Wallisova testu, zatímco párové srovnání bylo provedeno Mann-Whitneyovým testem s Bonferroniho úpravou chyby typu I.

Analýza dat byla provedena pomocí softwaru SPSS verze 16.0 a hladina statistické významnosti byla nastavena na p<0,05.