Mundgeruch und Parodontitis-bezogene Parameter

In der Literatur gibt es eine Debatte darüber, ob Parodontitis mit Mundgeruch verbunden ist, und diese Studie versucht zu verstehen, auf welche Weise Parodontitis mit Parametern im Zusammenhang mit Mundgeruch verbunden ist.

Klinisches Protokoll:

Achtundsiebzig systemisch gesunde Nichtraucher wurden in der Abteilung für Parodontologie der Aristoteles-Universität Thessaloniki, Griechenland, auf Mundgeruch untersucht. Dies waren Probanden, die sich nicht über Mundgeruch beschwerten. Nach einem anfänglichen Screening auf Eignung und Einholung einer unterzeichneten Einverständniserklärung, die von der Ethikkommission der Zahnmedizinischen Fakultät der Aristoteles-Universität Thessaloniki genehmigt wurde, wurde eine Parodontalaufzeichnung des gesamten Mundes erstellt, einschließlich Plaqueindex (PI), klinischer Sondierungstiefe (CPD), klinischer Befestigung -Werte (CAL) und Bluten beim Sondieren (BOP) an sechs Stellen pro Zahn unter Verwendung einer manuellen Parodontalsonde (Hu-Friedy XP-23/QW). Die Probanden, die die klinischen Einschlusskriterien erfüllten, wurden als chronische Parodontitis (N=28), chronische generalisierte Gingivitis (N=23) oder gesunde Personen (27) klassifiziert und weiter klinisch und mikrobiologisch überwacht.

Beurteilung des Zungenbelags:

Der Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) wurde visuell bestimmt, indem der Zungenrücken in Sextanten unterteilt wurde. Jedem Sextanten wurde je nach Anzahl der Einzahlungen eine Punktzahl zwischen null und zwei gegeben, und diese Punktzahlen wurden addiert, was eine Gesamtzahl von null bis 12 ergab.

Entnahme einer Zungenprobe:

Eine Probe wurde von der Rückseite des Zungenrückens zur quantitativen Analyse von zwei mutmaßlichen parodontalen Pathogenen, Porphyromonas gingivalis und Fusobacterium nucleatum, durch Echtzeit-PCR entnommen.

Um eine Beeinträchtigung der organoleptischen Beurteilungen und vor allem der Bewertung des Zungengeruchs durch Blutungen bei Sondierung und Zungenprobenahme zu vermeiden, wurden die Probanden bei einem zweiten Besuch zur gleichen Tageszeit und innerhalb von vier Tagen wegen Mundgeruchs einberufen Bewertung. Innerhalb dieses kurzen Zeitintervalls wurden die Teilnehmer gebeten, ihre routinemäßigen Ernährungs- und Mundhygienegewohnheiten nicht zu ändern, außer 48 Stunden vor dem nächsten Besuch, wenn die Halitosis-Bewertungen durchgeführt wurden (Roldán et al., 2003; Donaldson et al., 2007). . Jedem Teilnehmer wurden schriftliche Anweisungen bezüglich Essens- und Getränkekonsum und Mundhygienegewohnheiten gegeben. Genauer gesagt, wurden vor der Untersuchung stark gewürzte Speisen, Zwiebeln, Knoblauch, Alkohol und Mundspülungen vermieden 48 . Am Morgen der Auswertung wurde auf Kaffee, Pfefferminzbonbons, Kaugummi, Mundhygienepraktiken, duftende Kosmetika oder Aftershave-Lotion verzichtet. Die Aufnahme von Wasser und Mundspülungen mit Wasser waren mindestens zwei Stunden vor der Geruchsbewertung erlaubt. In ähnlicher Weise befolgte der Richter, der die organoleptischen Bewertungen des Mundgeruchs durchführte, 24 Stunden lang dieselben Anweisungen wie die Teilnehmer, bevor er die Untersuchungen durchführte.

Bewertung von Mundgeruch:

• Das Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) wurde verwendet, um die Konzentration von flüchtigen Sulfidverbindungen (VSC) in Teilen pro Milliarde (ppb) zu messen (Rosenberg et al., 1991). Die Bewertungen wurden immer zwischen 10:00 und 12:00 Uhr am selben Behandlungsstuhl in der Klinik durchgeführt, um die täglichen Schwankungen der Raumtemperatur und -feuchtigkeit zu minimieren (Liu et al., 2006);
• Organoleptische Bewertungen (ORG) im Bereich von null bis fünf (Rosenberg et al., 1991) bewerteten den Geruch der folgenden Parameter:

Vollständige Mundluft (ORG1) – Die Probanden wurden gebeten, sanft durch ein Sieb in ein 20 cm langes Röhrchen auszuatmen, um Augenkontakt mit dem Geruchsgutachter zu vermeiden, der den Atemgeruch am anderen Ende des Röhrchens bewertete (Murata et al., 2002) ; Vorderer Bereich des Zungenrückens (ORG2) – die Probanden wurden gebeten, ihre Handgelenke zu lecken und ein paar Sekunden zu warten, damit der Bereich trocknen konnte, bevor der Geruch bewertet wurde; Posteriorer Bereich der Zunge (ORG3) – Material wurde von der Rückseite des Zungenrückens in standardisierter Weise unter Verwendung eines Plastiklöffels entnommen; Nasenluft – Die Probanden wurden gebeten, durch ein Nasenloch auszuatmen, nachdem sie das gegenüberliegende Nasenloch mit ihrem Finger verschlossen hatten, um extraorale Ursachen auszuschließen, die mit Mundgeruch zusammenhängen könnten.

Ein kalibrierter einzelner „Untersucher“ zeichnete die Parodontalmessungen und Halimeter®-Messwerte auf, während ein kalibrierter „Richter“ die organoleptischen Bewertungen von Mundgeruch durchführte. Alle Teilnehmer wurden von demselben Prüfer und Richter bewertet. Um eine unvoreingenommene Datensammlung zu gewährleisten, wurde der Geruchsgutachter hinsichtlich der Halimeter®-Messungen und des klinischen Zustands der Person verblindet. Vor und während dieser Untersuchung wurden der Geruchsrichter und ein zusätzlicher Geruchs-„Bewerter“ wiederholt gegen eine Vielzahl von n-Butanol-Lösungen mit Intensitäten von 25 bis 6075 ppm standardisiert (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) und auch auf den Mundgeruch von Patienten in der Parodontalklinik. Um die Verlässlichkeit der Richterbewertungen zu beurteilen, untersuchten der Richter und der Gutachter den Mundgeruch mehrerer Studienteilnehmer, ohne die Bewertung des jeweils anderen zu kennen. Zwischen den Werten wurde eine statistisch signifikante Korrelation gefunden (Spearman's rho = 0,64 für den Geruch der gesamten Mundluft, p < 0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Es ist zu beachten, dass nur die Einschätzungen des Richters in die Datenanalyse einflossen.

Die Probanden wurden als Halitosis-positiv (+) bezeichnet, wenn entweder der organoleptische Wert der gesamten Mundluft zwei oder mehr betrug und/oder die Messwerte des Halimeters 140 p.p.b.

Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion:

Die DNA des P. gingivalis-Stammes W50 und des F. nucleatum-Stammes ATCC 10953 wurde an der Dental School der Universität Glasgow nach dem Standardprotokoll präpariert. Kurz gesagt wurden P. gingivalis und F. nucleatum auf anspruchsvollem anaeroben Agar gezüchtet und nach drei bis sieben Tagen geerntet. Die Organismen von einer einzelnen Agarplatte wurden mit Tupfern geerntet und in PBS dispergiert, das 0,1 mM Dinatrium-EDTA (PBSE) enthielt. Nach einmaligem Waschen in PBS wurden sie in 1 ml sterilem entionisiertem Wasser resuspendiert und in zwei 1,5-ml-Mikrokappen mit Schraubverschluss aliquotiert. DNA wurde aus den Organismen extrahiert, indem die Röhrchen zehn Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gestellt wurden. Das Lysat wurde fünf Minuten lang mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1; v/v/v) gemischt. Nach Zentrifugation (13000 U/min, 10 min) wurde die wässrige obere Phase von jeder Präparation in ein frisches Röhrchen überführt und fünf Minuten lang mit einem Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) gemischt. Nach Zentrifugation (13000 U/min, 10 min) wurde die wässrige obere Phase von jeder Präparation in ein frisches Röhrchen überführt und 0,1 Volumen 4,5 M Natriumacetatlösung (pH 5,4) und zwei Volumen Ethanol wurden hinzugefügt. DNA wurde über Nacht bei –20°C präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation (13000 U/min, 10 min) pelletiert, nacheinander in 1 ml 70 % Ethanol, 95 % Ethanol gewaschen und fast trocknen gelassen. Die DNA wurde dann in 100 &mgr;l Wasser gelöst. Die Nukleinsäurekonzentration und -reinheit wurde bei einer Wellenlänge von 260 Nanometer gemessen und das Verhältnis der Extinktion bei 260 und 280 Nanometer wurde unter Verwendung einer sterilen Quarzküvette in einem Spektrophotometer gemessen.

Zur quantitativen Analyse der 16S-rRNA von F. nucleatum und P. gingivalis in Zungenbelägen wurde in der aktuellen Studie ein Real-Time-PCR-Assay mit dem TaqMan-System (Yoshida et al., 2003) eingesetzt. Lysate von Proben wurden hergestellt, indem das Aliquot 10 Minuten lang gekocht wurde, nachdem die Kappe mit einer feinen sterilen Nadel durchstochen wurde, um einen Druckaufbau zu verhindern. Die PCR wurde mit einem Gesamtvolumen von 20 μl unter Verwendung des Kits Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland), jeweils 500 nM Sense- und Antisense-Primer, 200 nM Sonde und 5 μl lysierter Zellen durchgeführt. Die verwendeten artspezifischen Primer und TaqMan-Sonden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Spezifität der amplifizierten Produkte und damit der Primer wurde bereits früher bestätigt (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). Amplifikation und Detektion wurden mit dem LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Deutschland) mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt, die für beide Assays identisch waren: 95 °C für 10 min und dann 45 Zyklen von 95 °C für 10 s, 58 °C für 25 s und eine abschließende Elongation bei 40C für 30sec. Für jeden Assay wurde eine Standardkurve gezeichnet, indem Reihenverdünnungen bekannter Mengen gereinigter genomischer DNA jedes Testorganismus verwendet wurden.

Statistische Methoden:

Die statistische Nullhypothese, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Nachweis von Mundgeruch (Anwesenheit oder Abwesenheit) und dem Parodontalstatus bei Nichtrauchern gibt, wurde durch logistische Regression getestet. Da die Größe jeder klinischen Gruppe über 20 lag und die Mindestzahl an Mundgeruch-positiven Probanden pro klinischer Gruppe zehn überstieg, mit Ausnahme der gesunden Gruppe (neun Mundgeruch-positive Probanden), wurde die Stichprobengröße für die Anwendung dieser Statistik als angemessen erachtet Modell (Peduzzi et al. 1996).

Der Zusammenhang zwischen vorhandenem oder fehlendem Mundgeruch und klinischen Indizes (PI, CPD, CAL, BOP, Stellen > 5 mm CPD, WTCI) wurde mittels logistischer Regression untersucht. Der Rho-Korrelationskoeffizient nach Spearman schätzte die Assoziation zwischen den Skalenvariablen und auch die Übereinstimmung zwischen den Bewertungen der beiden Geruchsbewerter. Die Normalitätsannahme für Skalenvariablen wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet. Zwischengruppenvergleiche wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt, während paarweise Vergleiche durch den Mann-Whitney-Test mit Bonferronis Anpassung des Typ-I-Fehlers durchgeführt wurden.

Die Analyse der Daten wurde unter Verwendung der Software SPSS Version 16.0 durchgeführt und das Niveau der statistischen Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.