Cattivo odore orale e parametri correlati alla malattia parodontale

Esiste un dibattito in letteratura sul fatto che la parodontite sia collegata al cattivo odore orale e questo studio tenta di comprendere il modo in cui la malattia parodontale è associata ai parametri correlati al cattivo odore orale.

Protocollo clinico:

Settantotto non fumatori sistematicamente sani sono stati sottoposti a screening per l'alitosi orale presso il Dipartimento di Parodontologia dell'Università Aristotele di Salonicco, in Grecia. Questi erano soggetti che lamentavano non alitosi. Dopo lo screening iniziale per l'idoneità e l'ottenimento di un consenso informato firmato approvato dal Comitato Etico della Dental School, Università Aristotele di Salonicco, è stato registrato un grafico parodontale a bocca piena che includeva indice di placca (PI), profondità di sondaggio clinica (CPD), attacco clinico livelli (CAL) e sanguinamento al sondaggio (BOP) in sei siti per dente utilizzando una sonda parodontale manuale (Hu-Friedy XP-23/QW). I soggetti che soddisfacevano i criteri di inclusione clinica sono stati classificati come parodontite cronica (N=28), gengivite cronica generalizzata (N=23) o individui sani (27) e sono stati ulteriormente monitorati clinicamente e microbiologicamente.

Valutazione del rivestimento della lingua:

Il Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) è stato determinato visivamente dividendo il dorso della lingua in sestanti. Ad ogni sestante è stato assegnato un punteggio compreso tra zero e due in base alla quantità di depositi e questi punteggi sono stati sommati dando un totale compreso tra zero e 12.

Raccolta del campione di lingua:

Un campione è stato raccolto dalla parte posteriore del dorso della lingua per l'analisi quantitativa di due presunti patogeni parodontali, Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, mediante PCR in tempo reale.

Al fine di evitare l'interferenza del sanguinamento al sondaggio e al prelievo della lingua con le valutazioni organolettiche e principalmente con la valutazione dell'odore della lingua, i soggetti sono stati richiamati in una seconda visita alla stessa ora del giorno ed entro un periodo di quattro giorni per cattivo odore orale valutazione. All'interno di questo breve intervallo di tempo, ai partecipanti è stato chiesto di non modificare le loro abitudini alimentari e di igiene orale di routine tranne che per 48 ore prima della visita successiva, quando sono state effettuate le valutazioni dell'alitosi (Roldán et al., 2003; Donaldson et al., 2007). . Ad ogni partecipante sono state date istruzioni scritte riguardo al consumo di cibi e bevande e alle abitudini di igiene orale. Più in dettaglio, prima dell'esame sono stati evitati cibi piccanti, cipolla, aglio, alcol e collutori48. La mattina della valutazione sono stati evitati caffè, mentine, gomme da masticare, pratiche di igiene orale, cosmetici profumati o lozioni dopobarba. Il consumo di acqua e gli sciacqui orali con acqua sono stati consentiti almeno due ore prima della valutazione dell'odore. In modo analogo, il giudice che ha effettuato le valutazioni organolettiche del cattivo odore orale ha seguito le stesse istruzioni dei partecipanti per 24 ore prima di intraprendere gli esami.

Valutazione del cattivo odore orale:

• L'Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) è stato utilizzato per misurare la concentrazione di composti solforati volatili (VSC) in parti per miliardo (p.p.b.) (Rosenberg et al., 1991). Le valutazioni sono state effettuate sempre tra le 10.00 e le 12.00 presso la stessa poltrona odontoiatrica della clinica per ridurre al minimo la variabilità giornaliera della temperatura e dell'umidità della stanza (Liu et al., 2006);
• Le valutazioni organolettiche (ORG) che vanno da zero a cinque (Rosenberg et al., 1991) hanno valutato l'odore dei seguenti parametri:

Aria a bocca intera (ORG1) - ai soggetti è stato chiesto di espirare delicatamente in un tubo lungo 20 cm attraverso uno schermo, per evitare il contatto visivo con il giudice dell'odore, che ha valutato l'odore del respiro all'altra estremità del tubo (Murata et al., 2002) ; Regione anteriore del dorso della lingua (ORG2): ai soggetti è stato chiesto di leccarsi i polsi e di attendere un paio di secondi per consentire all'area di asciugarsi prima di valutare l'odore; Regione posteriore della lingua (ORG3): il materiale è stato raccolto dalla parte posteriore del dorso linguale in modo standardizzato utilizzando un cucchiaio di plastica; Aria dal naso - ai soggetti è stato chiesto di espirare attraverso una narice dopo aver tappato con il dito la narice opposta per escludere cause extraorali che potrebbero essere correlate all'alito cattivo.

Un singolo "esaminatore" calibrato ha registrato le misurazioni parodontali e le letture di Halimeter®, mentre un "giudice" calibrato ha effettuato le valutazioni organolettiche dell'alitosi. Tutti i partecipanti sono stati valutati dallo stesso esaminatore e giudice. Per garantire una raccolta di dati imparziale, il giudice dell'olfatto è stato accecato riguardo alle misurazioni di Halimeter® e allo stato clinico dell'individuo. Prima e durante questa indagine, il giudice dell'odore e un ulteriore "valutatore" dell'odore sono stati ripetutamente standardizzati contro un'ampia gamma di soluzioni di n-butanolo con intensità da 25 a 6075 parti per milione (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) e anche sull'odore della bocca dei pazienti che frequentano la clinica parodontale. Al fine di valutare l'attendibilità delle valutazioni del giudice, il giudice e il valutatore hanno esaminato l'odore della bocca di un certo numero di partecipanti allo studio senza essere consapevoli del punteggio dell'altro. Tra i punteggi è stata trovata una correlazione statisticamente significativa (Spearman's rho=0.64 per l'odore dell'aria di tutta la bocca, p<0.001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Va notato che solo le valutazioni del giudice sono state utilizzate nell'analisi dei dati.

I soggetti sono stati designati come alitosi positivi (+) quando il punteggio organolettico dell'intera aria della bocca era di due o più, e/o le letture dell'Halimeter® superavano i 140 p.p.b.

Reazione a catena della polimerasi in tempo reale:

Il DNA di P. gingivalis ceppo W50 e F. nucleatum ceppo ATCC 10953 è stato preparato presso la Dental School, Università di Glasgow seguendo il protocollo standard. In breve, P. gingivalis e F. nucleatum sono stati coltivati ​​su agar per anaerobi esigenti e raccolti dopo 3-7 giorni. Gli organismi da una singola piastra di agar sono stati raccolti con tamponi e dispersi in PBS contenente EDTA disodico 0,1 mM (PBSE). Dopo un lavaggio in PBS, sono stati risospesi in 1 ml di acqua deionizzata sterile e aliquotati in due microtappi a vite da 1,5 ml. Il DNA è stato estratto dagli organismi ponendo le provette in un bagno di acqua bollente per dieci minuti. Il lisato è stato miscelato con un uguale volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1; v/v/v) per cinque minuti. Dopo la centrifugazione (13000rpm, 10min) la fase acquosa superiore di ciascuna preparazione è stata trasferita in una nuova provetta e miscelata con un volume di cloroformio: alcool isoamilico (24:1) per cinque minuti. Dopo la centrifugazione (13000 rpm, 10 min) la fase acquosa superiore di ciascuna preparazione è stata trasferita in una nuova provetta e sono stati aggiunti 0,1 volumi di soluzione di acetato di sodio 4,5 M (pH 5,4) e due volumi di etanolo. Il DNA è stato precipitato durante la notte a -20°C. Il DNA è stato pellettato mediante centrifugazione (13000 rpm, 10 min) lavato in sequenza in 1 mL di etanolo al 70%, etanolo al 95% e lasciato asciugare quasi. Il DNA è stato quindi sciolto in 100 µl di acqua. La concentrazione e la purezza dell'acido nucleico sono state misurate a una lunghezza d'onda di 260 nanometri e il rapporto dell'assorbanza a 260 e 280 nanometri è stato misurato utilizzando una cuvetta di quarzo sterile in uno spettrofotometro.

Nell'attuale studio è stato utilizzato un test PCR in tempo reale utilizzando il sistema TaqMan (Yoshida et al., 2003) per l'analisi quantitativa dell'rRNA 16S di F. nucleatum e P. gingivalis nei rivestimenti della lingua. I lisati dei campioni sono stati preparati facendo bollire l'aliquota per 10 minuti dopo aver forato il tappo con un sottile ago sterile per evitare l'accumulo di pressione. La PCR è stata eseguita a un volume totale di 20 μl utilizzando il kit Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Germania), 500 nM ciascuno di primer senso e antisenso, sonda 200 nM e 5 μl di cellule lisate. I primer specifici per specie e le sonde TaqMan utilizzate sono mostrati nella Tabella 1. La specificità dei prodotti amplificati e quindi dei primer è stata confermata in precedenza (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). L'amplificazione e il rilevamento sono stati eseguiti con il sistema di rilevamento della sequenza LightCycler (Roche Diagnostics, Manheim, Germania) con le seguenti condizioni di ciclo, identiche per entrambi i test: 95°C per 10 minuti, quindi 45 cicli di 95°C per 10 secondi, 58°C per 25 secondi e un allungamento finale a 40C per 30sec. Una curva standard è stata tracciata per ciascun saggio utilizzando diluizioni seriali di quantità note di DNA genomico purificato di ciascun organismo testato.

Metodi statistici:

L'ipotesi statistica nulla che non vi sia alcuna associazione tra il rilevamento di alitosi (presenza o assenza) e lo stato parodontale nei soggetti non fumatori è stata testata mediante regressione logistica. Poiché la dimensione di ciascun gruppo clinico era superiore a 20 e il numero minimo di soggetti positivi all'alitosi per gruppo clinico superava i dieci, ad eccezione del gruppo sano (nove soggetti positivi all'alitosi), la dimensione del campione è stata ritenuta adeguata per l'applicazione di questa statistica modello (Peduzzi et al. 1996).

L'associazione tra presenza o assenza di alitosi e indici clinici (PI, CPD, CAL, BOP, siti > 5 mm CPD, WTCI) è stata esaminata utilizzando la regressione logistica. Il coefficiente di correlazione rho di Spearman ha stimato l'associazione tra le variabili di scala e anche l'accordo tra i punteggi dei due valutatori dell'odore. L'assunzione di normalità per le variabili di scala è stata testata dal test di Shapiro Wilk. I confronti tra i gruppi sono stati eseguiti utilizzando il test di Kruskal-Wallis, mentre i confronti a coppie sono stati condotti mediante il test di Mann-Whitney con l'aggiustamento di Bonferroni dell'errore di tipo I.

L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software SPSS versione 16.0 e il livello di significatività statistica è stato fissato a p<0,05.