Vertikální expozice viru Zika a jeho důsledky pro dětský neurovývoj (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

Hlavním cílem studie je posoudit přirozenou historii vertikálního přenosu ZIKV od těhotenství do konce třetího roku života a existenci rizikových faktorů spojených s výskytem klinických a neurologických poruch, zejména mikrocefalie.

Bude provedena longitudinální studie od těhotenství do konce třetího roku života, během kterého bude hlavní expozicí infekce ZIKV.

Velikost vzorku bude 500 dětí vystavených viru zika. Velikost vzorku byla vypočtena pro vzácné příhody na základě obvyklé prevalence mikrocefalie v Brazílii (2:10 000) a očekávaný nárůst počtu případů mezi těhotnými ženami vystavenými ZIKAVu.

Studie bude provedena v Národním institutu pro zdraví žen a dětí (IFF) Fernandese Figueira. Těhotné ženy budou vybrány na klinice prenatální péče na IFF a v odděleních Strategie zdraví rodiny v Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), které jsou obě z FioCruz/RJ. Přijmeme také těhotnou ženu z klinické rodiny SMS Rio de Janeiro.

Kritéria pro zařazení Populace studie bude složena z těhotných žen, které vykazují symptomy kompatibilní s infekcí ZIKAV, s kožní vyrážkou, horečkou spojenou s artralgií, myalgií, nehnisavou konjunktivitidou nebo bolestí hlavy a asymptomatické těhotné ženy identifikované ve stejnou dobu s možností expozice . Zařadíme pacienty s pozitivní RT-PCR.

Všechny těhotné ženy, které jsou v prenatálním sledování na IFF a CSGSF, bez ohledu na gestační věk, jsou na začátku způsobilé jako neexponované.

Kritéria vyloučení Těhotné ženy s chromozomálními abnormalitami zjištěnými během života plodu nebo porodu budou vyloučeny.

Definice expozice Vzhledem k poznatku, že asi 80 % infekcí ZIKAV je asymptomatických, bude expozice potvrzena pozitivitou v diagnostických testech (PCR nebo sérologické testy). S ohledem na budoucí dostupnost sérologických testů budou pro definování expozičních skupin použity některé strategie, protože dosud je k dispozici pouze PCR test, který zůstává pozitivní pouze v akutní fázi onemocnění.

Jak je popsáno výše, symptomatické ženy budou odeslány k potvrzení diagnózy infekce pomocí RT-PCR a sérologických testů na horečku dengue, chikcungunha, CMV, toxoplazmózu a zarděnky.

Ženám s příznaky i bez nich budou odebrány vzorky krve pro sérologické testy ve třech trimestrech těhotenství a při porodu. Vzorky krve budou uloženy v bioúložišti pro sérologické vyšetření ZIKA, jakmile budou k dispozici specifické sérologické testy. Tyto sekvenční vzorky budou také použity k validaci sérologických testů, které jsou ve fázi vývoje.

Srovnávané skupiny expozice budou složeny na základě výsledků sérologických testů. Do skupiny exponovaných budou migrovat asymptomatičtí jedinci, jejichž krevní vzorky naznačují přítomnost infekce Zika v budoucnu.

Těhotné ženy v kohortě vykazující pozitivní výsledky specifických testů (PCR v akutní fázi a později sérologické testy) budou považovány za vystavené infekci, zatímco těhotné ženy s negativními výsledky budou považovány za neexponované.

Tato druhá skupina může být kategorizována jako asymptomatická a symptomatická. Třetí skupinou budou normální děti narozené matkám bez zika prokázané negativní IgG a IgM. Každé dítě bude sledováno po dobu tří let od narození.

Výsledky, které mají být analyzovány Hlavním výsledkem bude mikrocefalie a/nebo zpoždění ve vývoji pomocí Bayley Score 3. vydání ve věku 12, 18 a 24-36 měsíců.

Sekundární výsledky studie budou následující: stav ultrazvuku v těhotenství, poranění placenty, oční, sluchové, srdeční, nutriční stav dětí a neurovývojové změny od narození do tří let, úmrtí těhotných žen, potrat, úmrtí plodu a úmrtí během porodu. první tři roky života.

Sběr dat:

K zahrnutí těhotných žen dojde během prvních 24 měsíců studie. K identifikaci výsledků bude každé dítě sledováno od narození do dovršení tří let chronologického věku. Celková doba studie pro sběr dat bude 5 let. Studie bude probíhat v období od ledna 2016 do března 2022.

Data budou shromažďována zdravotníky, kteří jsou napojeni na zdravotnické služby a poskytují pomoc studované populaci.

Údaje o těhotenství, porodu a prvních třech letech života budou získány z rozhovoru s každou ženou pomocí dotazníku po domluvě. Kromě toho budou data pro záznamy shromažďována ve formulářích připravených pro tento účel.

Formulář pro sběr dat (CRF/DCF) bude vytvořen a ověřen ve všech svých dimenzích mezi službami. Budou připraveny POPs pro vývojový diagram studie a pro každý postup a úroveň péče.

• Socioekonomické charakteristiky (vzdělání, rodinný příjem na hlavu, podmínky bydlení, hygiena a odvoz odpadu); zdravotní stavy (přidružená onemocnění).
• Historie expozice ZIKAV: identifikace příbuzných, sousedů a kolegů z práce se Zikou

Sledování studované populace

Sledování těhotných žen:

Těhotné ženy zahrnuté do studie budou sledovány na prenatální klinice v Národním brazilském institutu pro zdraví žen a dětí Fernandes Figueira.

Po zařazení těhotných žen do studie budou konzultace probíhat měsíčně a vyšetření budou prováděna podle následujícího protokolu:

• Fetální ultrazvuk v každém trimestru
• Sérologická vyšetření na Zika, dengue, chikungunya, CMV, toxoplazmózu a zarděnky každý trimestr
• PCR pro virus Zika u symptomatické těhotné ženy
• Prenatální vyšetření podle doporučení Stork Network od brazilského ministra zdravotnictví
• Prenatální vyšetření podle doporučení Brazilian Stork Network Plodová voda může být odebrána, pokud je to indikováno přítomností přidružených vrozených anomálií.

Doppler:

Pupeční šňůra bude insonována, aby se získal sonogram pupeční tepny a tak se vyhodnotil index pulzace (PI), index odporu (RI) a maximální systolická rychlost (PSV).

Detekce viru v séru a jiných lidských sekretech Pro detekci viru u pacientů se RNA extrahuje ze séra a/nebo moči (200 ml) pomocí soupravy RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Německo) podle pokynů výrobce. Izolovaná RNA slouží jako templát v reakcích /RT-PCR v reálném čase, jak popsali: Lanciotti et al., 2008 a Faye et al., 2013.

Detekce viru v séru a jiných lidských sekretech Pro genomové sekvenování budou specifické oblasti genomu viru amplifikovány metodou RT-PCR. Takto získané produkty budou purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu a poté extrahovány z gelu pomocí soupravy QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Po extrakci bude materiál kvantifikován v agarózovém gelu porovnáním intenzit pásů pomocí standardu Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). Částka potřebná pro sekvenování bude předána sekvenační platformě Fiocruz. Sekvence budou ručně upravovány pomocí Bioedit (v. 7.0.5.3) a fylogenetické analýzy budou provedeny pomocí MEGA (v. program 5:05).

Analýza placenty a imunohistochemie Čerstvé placenty budou předány na Ústav patologické anatomie a cytopatologie (DAPC/DPAC), kde budou uchovávány v chladničce po dobu až 48 hodin. Jsou popsány, zváženy a fotografovány podle rutiny pro analýzu placenty. Fragmenty z choriové desky, provazce a membrán budou odstraněny a zmrazeny v kapalném dusíku. Placentární ploténka (pět oblastí), provazec (alespoň dvě oblasti) a chorion (jeden fragment) budou fixovány v pufrovaném formalínu maximální doba: 30 hodin. Poté budou štěpeny pro histologické zpracování a uloženy do parafínu.

Fenotypová charakterizace placentárních buněk a mateřské a pupečníkové krve a dětských ústních výtěrů průtokovou cytometrií Fragmenty placenty budou odebrány a uchovávány ve sterilním kultivačním médiu DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) (4 °C) a rozštěpeny na několik fragmentů (tloušťka: 1-2 mm). Po štěpení se promyjí v DMEM a podrobí se disociačním cyklům v enzymu kolagenázy 1A (Sigma; _) (300 U/mg; v 1% DMEM). K disociaci dojde v 6-8 cyklech (mírné míchání; 37 °C, každý 10 minut). Takto získaná buněčná suspenze se odstředí (1000 ot./min; 4 °C; 10 min) a peleta se umístí/suspenduje v DMEM s fetálním telecím sérem (FCS; 10 %; Sigma; _; 4 °C), aby se /inaktivovala/ inhibovat enzym/působení/aktivitu kolagenázy?. Disociovaný materiál bude [pak] filtrován /in /přes?a membrána ([průměr pórů:] 70 mm). Poté budou buňky spočítány v Neubauerově komoře pro použití v následujících postupech. Mateřská a pupečníková krev budou odebrány do /krve /vhodné zkumavky obsahující EDTA jako antikoagulant. Sérum bude použito pro detekci virů a leukocytové buňky budou označeny po lýze červených krvinek.\

Pitva plodů a mrtvě narozených V důsledku infekce ZIKAV budou provedeny histopatologické a imunohistochemické vyšetření a zobrazovací studie morfogeneze mozku a dalších orgánů plodů a mrtvě narozených dětí. Kromě obvyklého histologického zpracování v parafínu budou ostatní orgány zmrazeny a podrobeny extrakci genetického materiálu a vyšetření virové RNA. Oční bulva bude také analyzována, aby se vyhodnotily možné změny oka.

Sledování novorozenců:

Novorozenci budou do 3 let sledováni v ambulanci IFF, jejíž rutina zahrnuje minimálně 6 návštěv v prvním roce, 4 návštěvy ročně ve druhém a třetím roce. Na infekčním oddělení a dětské ambulanci bude zřízena multioborová ambulance pro sledování kohorty dětí s možností vertikální expozice viru ZIKA. Ambulance bude mít zdravotnický personál a odborníky v oblasti fyzikální terapie, fonoaudiologie, psychologie a sociálních služeb. Lékařský tým bude zodpovědný za sledování pacientů ve spolupráci se specializacemi jako je neurologie, dětská kardiologie a oftalmologie a lékařská genetika. Kdykoli to bude nutné, přijetí těchto pacientů ke stanovení [buď] diagnózy nebo počátečního přístupu – {případu} proběhne na oddělení DIPe.

Počáteční hodnocení doporučené pro pacienty, o kterých je známo, že jsou vystaveni viru nebo s mikrocefalií, se bude skládat z následujících vyšetření a/nebo hodnocení: neurologické, oční, sluchové, EEG, je-li to nutné, EKG, pupečníková krev pro RT-PCR a IgM. Antropometrická data a fyzikální vyšetření novorozence s důrazem na přesné měření obvodu hlavy pomocí mezirůstové křivky (2014) jako referenční, podle gestačního věku a pohlaví pacienta. Vyhodnocení genetiky k odhalení dysmorfických charakteristik nebo vrozených anomálií, které mohou ohrozit/ovlivnit jiné orgány.

Zobrazovací zkoušky:

1. transfontanelová sonografie (USTF), jako první volba
2. kraniální tomografie (CT) bez kontrastu, pokud TF není technicky možná
3. Ultrazvuk břicha
4. Echokardiogram
5. Magnetická rezonance mozku, je-li indikována. g) Sluchový screening novorozenců (TAN):

1. Evokované optoakustické emise (EOAE); 24-48 h života 2. Sluchově evokovaný potenciál mozkového kmene (PEATE/ABR): do 1 měsíce života u dětí s mikrocefalií. V případě neúspěchu je nutné do 30 dnů provést nové testování. V případě neúspěchu při opakovaném testu předejte [NB] ihned [na _].

h) Oční novorozenecký screening (TON):

1. Kontrola a testování červeného odrazu sítnice.
2. Zkouška očního fondu (fundoskopie)
3. Dokumentace s RetCam

V následných konzultacích bude zachováno klinické sledování, měření PC, hodnocení vývoje (včetně časné stimulace) fyzikální terapií a hodnocení morbidity a mortality. V prvním roce života se bude PEATE provádět každé tři měsíce. Následné návštěvy kliniky budou probíhat měsíčně do 6 měsíců věku, každé dva měsíce v období 6-12 měsíců a každé tři měsíce do tří let [života]. Oftalmologické vyšetření (fundoskopické vyšetření) bude probíhat při každém návratu.

Neurologické sledování bude záviset na počátečním stavu pacienta. Pacienti bez mikrocefalie budou hodnoceni při narození, 30 dnů a 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 a 36 měsíců. Pacienti s mikrocefalií budou vyšetřeni při narození, po 30 dnech a každé 2 nebo 3 měsíce, nebo v případě potřeby častěji.

Vyhodnocení motorického vývoje bude provedeno pomocí Dubowitzova vyšetření (v prvních 72 hodinách), Alberta Infant Motor Scale (AIMS; každé tři měsíce, dokud dítě nebude chodit nebo dovrší 18 měsíců života) a Bayleyho testu-3. vydání ve 12, 18 a mezi 12-36 měsíci věku.

Hodnocení vývoje jazyka bude provedeno ve 12., 24. a 36. měsíci s ohledem na možné vlivy na neurovývoj, kognitivní vývoj a jazykové dovednosti.