Pionowe narażenie na wirusa Zika i jego konsekwencje dla rozwoju neurologicznego dziecka (ZIKVIRUSIFF) (ZIKVIRUSIFF)

Głównym celem pracy jest ocena naturalnego przebiegu wertykalnej transmisji wirusa ZIKV od ciąży do końca trzeciego roku życia oraz istnienie czynników ryzyka związanych z występowaniem zaburzeń klinicznych i neurologicznych, zwłaszcza małogłowia.

Badanie podłużne zostanie przeprowadzone od ciąży do końca trzeciego roku życia, podczas którego głównym narażeniem będzie zakażenie ZIKV.

Wielkość próby wyniesie 500 dzieci narażonych na kontakt z wirusem Zika. Wielkość próby obliczono dla rzadkich zdarzeń na podstawie typowej częstości występowania mikrocefalii w Brazylii (2:10 000) i oczekiwany wzrost liczby przypadków wśród kobiet w ciąży narażonych na ZIKAV.

Badanie zostanie przeprowadzone w Narodowym Instytucie Zdrowia Kobiet i Dzieci im. Fernandesa Figueiry (IFF). Kobiety w ciąży zostaną wybrane w klinice opieki prenatalnej w IFF oraz w jednostkach Strategii Zdrowia Rodziny w Centro de Saúde Escola Germano Sinval Faria (CDEGSF), które pochodzą z FioCruz/RJ. Przyjmiemy również kobietę w ciąży z rodziny klinicznej SMS Rio de Janeiro.

Kryteria włączenia Badana populacja będzie się składać z kobiet w ciąży, które wykazują objawy zgodne z zakażeniem ZIKAV, z wysypką skórną, gorączką związaną z bólem stawów, bólem mięśni, nieropnym zapaleniem spojówek lub bólem głowy oraz bezobjawowymi kobietami w ciąży, u których w tym samym czasie stwierdzono możliwość narażenia . Włączymy pacjentów z pozytywnym wynikiem RT-PCR.

Wszystkie ciężarne będące w trakcie kontroli prenatalnej w IFF i CSGSF, niezależnie od wieku ciążowego, kwalifikują się jako nienarażone na początku.

Kryteria wykluczenia Kobiety w ciąży z nieprawidłowościami chromosomalnymi wykrytymi podczas życia płodowego lub porodu zostaną wykluczone.

Definicja narażenia Biorąc pod uwagę, że około 80% zakażeń ZIKAV przebiega bezobjawowo, ekspozycja zostanie potwierdzona pozytywnym wynikiem testów diagnostycznych (PCR lub testów serologicznych). Biorąc pod uwagę przyszłą dostępność testów serologicznych, niektóre strategie zostaną wykorzystane do określenia grup narażenia, ponieważ dotychczas dostępny jest tylko test PCR, który pozostaje dodatni tylko w ostrej fazie choroby.

Jak opisano powyżej, kobiety z objawami zostaną skierowane w celu potwierdzenia rozpoznania infekcji za pomocą RT-PCR oraz testów serologicznych w kierunku dengi, chikcungunha, CMV, toksoplazmozy i różyczki.

Kobiety z objawami i bez objawów będą miały pobieraną krew do badań serologicznych w trzech trymestrach ciąży i po urodzeniu. Próbki krwi będą przechowywane w biorepozytorium do badań serologicznych ZIKA, gdy dostępne będą określone testy serologiczne. Te sekwencyjne próbki zostaną również wykorzystane do walidacji testów serologicznych, które są na etapie opracowywania.

Grupy narażenia, które mają być porównane, zostaną utworzone na podstawie wyników testów serologicznych. Osoby bezobjawowe, których próbki krwi wykażą obecność zakażenia Zika w przyszłości, będą migrować do grupy narażonych.

Ciężarne z kohorty, które wykażą się pozytywnymi wynikami określonych testów (PCR w fazie ostrej i później testy serologiczne) zostaną uznane za narażone na zakażenie, natomiast ciężarne z wynikiem ujemnym zostaną uznane za nienarażone.

Tę drugą grupę można podzielić na bezobjawową i objawową. Trzecią grupą będą normalne dzieci urodzone z matek bez wirusa Zika potwierdzone ujemnymi IgG i IgM. Każde dziecko będzie obserwowane przez trzy lata od urodzenia.

Wyniki do analizy Głównym wynikiem będzie małogłowie i/lub opóźnienie rozwoju przy użyciu Bayley Score 3rd edition w wieku 12, 18 i 24-36 miesięcy.

Wtórnymi wynikami badań będą: stan ciąży w USG, urazy łożyska, narządu wzroku, słuchu, serca, stan odżywienia dzieci i zmiany neurorozwojowe od urodzenia do trzeciego roku życia, zgon kobiety w ciąży, poronienie, zgon płodu, zgon w trakcie pierwsze trzy lata życia.

Gromadzenie danych:

Włączenie kobiet w ciąży nastąpi w pierwszych 24 miesiącach badania. Aby określić wyniki, każde dziecko będzie obserwowane od urodzenia do ukończenia trzeciego roku życia chronologicznego. Całkowity okres badania w celu gromadzenia danych wyniesie 5 lat. Badanie zostanie przeprowadzone w okresie styczeń 2016 – marzec 2022.

Dane będą zbierane przez pracowników służby zdrowia, którzy są powiązani ze służbą zdrowia i udzielają pomocy badanej populacji.

Dane dotyczące ciąży, porodu i pierwszych trzech lat życia zostaną pozyskane z wywiadu z każdą kobietą za pomocą kwestionariusza po wizycie. Ponadto dane do ewidencji będą gromadzone w przygotowanych w tym celu formularzach.

Formularz zbierania danych (CRF/DCF) zostanie skonstruowany i zweryfikowany we wszystkich swoich wymiarach wśród usług. Przygotowane zostaną POP dla schematu przebiegu badania oraz dla każdej procedury i poziomu opieki.

• Cechy społeczno-ekonomiczne (wykształcenie, dochód rodziny na mieszkańca, warunki mieszkaniowe, warunki sanitarne i wywóz śmieci); warunki zdrowotne (choroby współistniejące).
• Historia narażenia na ZIKAV: identyfikacja krewnych, sąsiadów i współpracowników z Zika

Obserwacja badanej populacji

Obserwacja kobiet w ciąży:

Kobiety w ciąży objęte badaniem będą obserwowane w klinice prenatalnej w Narodowym Brazylijskim Instytucie Zdrowia Kobiet i Dzieci im. Fernandesa Figueiry.

Po włączeniu kobiet ciężarnych do badania, konsultacje odbywać się będą co miesiąc, a badania wykonywane będą według następującego protokołu:

• USG płodu w każdym trymestrze ciąży
• Badania serologiczne w kierunku Zika, dengi, chikungunya, CMV, toksoplazmozy i różyczki w każdym trymestrze ciąży
• PCR w kierunku wirusa Zika u objawowej kobiety w ciąży
• Badania prenatalne zgodnie z zaleceniami Stork Network od brazylijskiego ministra zdrowia
• Badania prenatalne zgodnie z zaleceniami brazylijskiej sieci bocianów Płyn owodniowy można pobrać, jeśli jest to wskazane przez obecność towarzyszących wad wrodzonych.

Doppler:

Pępowina zostanie naświetlona w celu uzyskania USG tętnicy pępowinowej, a tym samym oceny wskaźnika pulsacji (PI), wskaźnika oporu (RI) i szczytowej prędkości skurczowej (PSV).

Wykrywanie wirusa w surowicy i innych wydzielinach ludzkich W celu wykrycia wirusa u pacjentów, RNA ekstrahuje się z surowicy i/lub moczu (200 ml) przy użyciu zestawu RTP Pathogen (Stratec Biomedical AG, Birkenfeld, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizolowany RNA służy jako matryca w reakcjach PCR w czasie rzeczywistym /RT-PCR, jak opisali: Lanciotti i in., 2008 e Faye i in., 2013.

Wykrywanie wirusa w surowicy i innych ludzkich wydzielinach W celu sekwencjonowania genomu, określone regiony genomu wirusa zostaną zamplifikowane metodą RT-PCR. Tak otrzymane produkty zostaną oczyszczone za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie ekstrahowane z żelu przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Po ekstrakcji materiał zostanie oznaczony ilościowo w żelu agarozowym przez porównanie intensywności prążków przy użyciu standardu Low DNA Mass Ladder (Life Technologies). Ilość potrzebna do sekwencjonowania zostanie przekazana do platformy sekwencjonowania Fiocruz. Sekwencje będą edytowane ręcznie za pomocą narzędzia Bioedit (v. 7.0.5.3), a analizy filogenetyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu programu MEGA (v. 5:05) programu.

Analiza łożyska i immunohistochemia Świeże łożyska zostaną przekazane do Zakładu Anatomii Patologicznej i Cytopatologii (DAPC/DPAC), gdzie będą przechowywane w lodówce do 48 godzin. Są one opisywane, ważone i fotografowane zgodnie z rutynową analizą łożyska. Fragmenty płytki kosmówkowej, pępowiny i błon zostaną usunięte i zamrożone w ciekłym azocie. Płytka łożyskowa (pięć obszarów), pępowina (co najmniej dwa obszary) i kosmówka (jeden fragment) zostaną utrwalone w buforowanej formalinie w maksymalnym czasie 30 h). Zostaną one następnie rozcięte do obróbki histologicznej i zatopione w parafinie.

Charakterystyka fenotypowa komórek łożyska oraz krwi matki i pępowiny oraz wymazu z jamy ustnej dziecka za pomocą cytometrii przepływowej. Fragmenty łożyska zostaną zebrane i utrzymane w sterylnej pożywce hodowlanej DMEM (Sigma; St. Louis, MO, [USA]) (4 °C) i pocięte na kilka fragmentów (grubość: 1-2 mm). Po rozszczepieniu przemywa się je DMEM i poddaje cyklom dysocjacji w enzymie kolagenaza 1A (Sigma; _) (300 U/mg; w 1% DMEM). Dysocjacja nastąpi w 6-8 cyklach (łagodne mieszanie; 37°C, 10 min każdy). Tak otrzymaną zawiesinę komórek odwiruje się (1000 obr./min; 4°C; 10 min), a osad zostanie umieszczony /zawieszony w DMEM z płodową surowicą cielęcą (FCS; 10%; Sigma; _; 4°C) w celu /inaktywacji/ hamują enzym / działanie / aktywność kolagenazy?. Zdysocjowany materiał zostanie [wtedy] przefiltrowany /w /przez?a membrana ([średnica porów:] 70 mm). Następnie komórki zostaną zliczone w komorze Neubauera do wykorzystania w poniższych procedurach. Krew matki i pępowinowa zostanie pobrana do / krwi / odpowiedniej probówki zawierającej EDTA jako antykoagulant. Surowica zostanie użyta do wykrywania wirusów, a komórki leukocytów zostaną oznaczone po lizie krwinek czerwonych.\

Sekcja zwłok płodów i martwych urodzeń Badania histopatologiczne i immunohistochemiczne oraz obrazowe badanie morfogenezy zostaną wykonane w mózgu i innych narządach z płodów i martwych urodzeń /w następstwie zakażenia ZIKAV. Oprócz zwykłej obróbki histologicznej w parafinie, pozostałe narządy zostaną zamrożone i poddane ekstrakcji materiału genetycznego oraz badaniu wirusowego RNA. Gałka oczna zostanie również przeanalizowana w celu oceny możliwych zmian w oku.

Obserwacja noworodków:

Noworodki będą objęte obserwacją do 3 roku życia w poradni IFF, której rutyna obejmuje co najmniej 6 wizyt w pierwszym roku, 4 wizyty/rok w drugim i trzecim roku. Zarówno w Oddziale Chorób Zakaźnych Pediatrii, jak i Poradni Pediatrycznej zostanie powołana multidyscyplinarna przychodnia do obserwacji kohorty dzieci zagrożonych ekspozycją wertykalną na wirusa ZIKA. W ambulatorium zatrudniony będzie personel medyczny oraz specjaliści z zakresu fizjoterapii, fonoaudiologii, psychologii i pomocy społecznej. Opiekę nad pacjentami będzie sprawował zespół medyczny we współpracy ze specjalnościami takimi jak neurologia, kardiologia i okulistyka dziecięca oraz serwis genetyki medycznej. W razie potrzeby przyjęcie tych pacjentów w celu ustalenia [albo] diagnozy, albo wstępnego podejścia - {przypadku} nastąpi na oddziale DIPe.

Wstępna ocena zalecana dla pacjentów, u których wiadomo, że są narażeni na kontakt z wirusem lub z małogłowiem, będzie składać się z następujących badań i/lub ocen: neurologicznych, narządu wzroku, słuchu, EEG, jeśli to konieczne, EKG, krwi pępowinowej do RT-PCR i IgM. Dane antropometryczne i badanie fizykalne noworodka, z naciskiem na precyzyjny pomiar obwodu głowy przy użyciu krzywej wzrostu (2014) jako punktu odniesienia, w zależności od wieku ciążowego i płci pacjentki. Ocena przeprowadzona przez genetyków w celu wykrycia cech dysmorficznych lub wrodzonych anomalii, które mogą zagrażać/wpływać na inne narządy.

Badania obrazowe:

1. sonografia przezciemiączkowa (USTF), jako pierwszy wybór
2. tomografia czaszki (CT) bez kontrastu, jeśli TF nie jest technicznie możliwe
3. USG jamy brzusznej
4. Echokardiogram
5. Rezonans magnetyczny mózgu, jeśli jest to wskazane. g) Przesiewowe badanie słuchu noworodków (TAN):

1. Wywołane emisje optoakustyczne (EOAE); 24-48 h życia 2. Słuchowe potencjały wywołane pnia mózgu (PEATE/ABR): do 1 miesiąca życia u dzieci z małogłowiem. W przypadku niepowodzenia ponowne badanie należy wykonać w ciągu 30 dni. W przypadku niepowodzenia ponownego testu prześlij [NB] natychmiast [do _].

h) Badania przesiewowe noworodków (TON):

1. Kontrola i badanie siatkówkowego czerwonego odbicia.
2. Badanie Funduszu Ocznego (fundoskopia)
3. Dokumentacja z RetCam

W kolejnych konsultacjach utrzymana zostanie obserwacja kliniczna, pomiar PC, ocena rozwoju (w tym wczesna stymulacja) poprzez fizjoterapię oraz ocena zachorowalności i śmiertelności. W pierwszym roku życia PEATE będzie wykonywany co trzy miesiące. Kolejne wizyty w poradni będą odbywać się co miesiąc do 6 miesiąca życia, co 2 miesiące w okresie 6-12 miesięcy, a co 3 miesiące do 3 roku życia. Ocena okulistyczna (badanie dna oka) odbywać się będzie przy każdym powrocie.

Dalsza obserwacja neurologiczna będzie zależała od początkowego stanu pacjenta. Pacjenci bez małogłowia będą oceniani po urodzeniu, 30 dniu i 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24 i 36 miesiącu. Pacjenci z małogłowiem będą oceniani po urodzeniu, 30 dniu i co 2 lub 3 miesiące lub częściej, jeśli to konieczne.

Oceny rozwoju motorycznego dokona badanie Dubowitza (w pierwszych 72 godzinach), Alberta Infant Motor Scale (AIMS; co trzy miesiące do momentu, gdy dziecko zacznie chodzić lub ukończy 18 miesięcy życia) oraz Bayley Test – 3 edycja w wieku 12 lat, 18 i między 12 a 36 miesiącem życia.

Ocena rozwoju języka zostanie przeprowadzona po 12, 24 i 36 miesiącach, w odniesieniu do możliwego wpływu na rozwój neurologiczny, rozwój poznawczy i umiejętności językowe.