Hledejte přenos bovinní miRNA na lidi

Strava hraje důležitou roli ve zdraví i chorobných procesech; studium vlivu stravy na expresi a regulaci genů umožní lépe porozumět vztahu mezi stravou a zdravím. Jedním z nejvíce studovaných mechanismů genové regulace v současnosti je mikroRNA (miRNA). miRNA jsou malé nekódující RNA (přibližně ~22 nukleotidů), které regulují genovou expresi na post-transkripční úrovni a ovlivňují procesy, jako je vývoj, homeostáza, imunitní odpověď, metabolismus a epigenetické procesy. miRNA se vážou na specifické sekvence v transkriptech cílové mRNA, aby potlačily translaci nebo vyvolaly degradaci mRNA. miRNA jsou stabilně přítomné v různých biofluidách a některé mohou být přímo absorbovány buňkami příjemce pro kontrolu genové exprese a buněčných funkcí.

Přenos funkční exogenní RNA byl prokázán u bakteriálních a virových infekcí, ale je méně dobře charakterizován u savců. Potraviny získané z rostlin a zvířat obsahují miRNA a některé zprávy odhalily miRNA získané ze stravy cirkulující v séru savců. Tato zjištění podporují přenos specifických miRNA do savčí tkáně po konzumaci potravy napříč královstvími. Stále však není jasné, zda miRNA přítomné v potravinách pocházejících z rostlin a zvířat mohou být absorbovány gastrointestinálním traktem a přeneseny do tkání, aby vykonávaly regulační funkce pro křížovou regulaci genové exprese mezi druhy. Doručování funkčních miRNA ze zdrojů pocházejících ze stravy přes gastrointestinální bariéru by mohlo být relevantní pro výživu, zemědělství, lidské zdraví a mohlo by mít mnoho potenciálních aplikací v terapeutickém cílení. Ve světle kontroverzních zjištění o miRNA pocházejících ze stravy je třeba prozkoumat otázku, zda je možné určit přenos funkční exogenní miRNA u savců. Výzkumníci studovali možný přenos miRNA pocházejících ze stravy ze zvířecí tkáně do lidské plazmy, protože hovězí maso je důležitou složkou stravy v severovýchodním Mexiku a jeho konzumace je spojována jako potenciální rizikový faktor pro různé patologické stavy, včetně kolorektálního karcinomu.

Metody Účastníci studie: Protokol byl schválen etickou komisí. Do studie bylo zařazeno třicet dobrovolníků, patnáct všežravých a patnáct veganů (kontrolní skupina). Jeden všežravý subjekt zkoušku nedokončil. Před zařazením do studie byl od všech účastníků získán písemný informovaný souhlas. Pro ověření zdravotního stavu účastníků byla provedena antropometrická měření, hematická biometrie a sérová chemie.

Kritéria pro zařazení a vyloučení: Byli přijati zdraví dobrovolníci ve věku 18 až 30 let, schopní poskytnout informovaný souhlas, s podobnými antropometrickými charakteristikami. Účastníci byli rozděleni do dvou skupin: všežravci a vegani (kontrola). Kritériem pro zařazení pro všežravé subjekty bylo, že by měli konzumovat hovězí maso alespoň třikrát týdně. Kritériem zařazení pro veganské subjekty bylo, že by měli dodržovat přísnou veganskou stravu po dobu alespoň jednoho roku. Kritéria vyloučení pro všechny subjekty zahrnovala těhotenství, menstruaci během odběru studijních vzorků, užívání léků nebo potravinových doplňků, střevní malabsorpci a nesnášenlivost složek zahrnutých do dietní intervence.

Postup studie: Základní krevní vzorky byly získány po 12 hodinách přes noc nalačno; postprandiální stav miRNA byl měřen po požití jídla s hovězím masem (testovací jídlo), které sestávalo z 200 g rostbífu se salátem (hlávkový salát, rajče, čočka) a šálkem rýže. Kontrolní dieta sestávala ze stejného zásahu, bez rostbífu. Každý intervenční den byla jídla připravována z čerstvých potravin. Účastníci jedli pod kontrolou studijního personálu. Postprandiální vzorky byly odebrány 2, 4 a 6 hodin po dietním zásahu. Subjekty až do konce odběru vzorků znovu nejedly ani nepily.

Vzorky lidské plazmy byly odebrány do vakuových zkumavek obsahujících EDTA; přibližně 5 ml krve bylo odebráno podle standardních postupů v každém časovém bodě (0, 2, 4 a 6 hodin). Plazma byla oddělena odstředěním po dobu 15 minut při 2 000 x g při teplotě místnosti s následným zmrazením na -80 °C, dokud nebyly provedeny analýzy.

Izolace RNA: Extrakce plazmatické RNA: rozmražené vzorky plazmy byly odstředěny a supernatant plazmy (200 ul) byl použit pro čištění celkové RNA včetně malých RNA; Extrakce RNA byla provedena pomocí miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce.

Extrakce hovězí RNA: Celková RNA včetně malých RNA byla extrahována ze syrového a vařeného hovězího masa pomocí miRNeasy Mini Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce. Vzorky 50 mg bleskově zmrazeného syrového nebo vařeného hovězího masa byly umístěny do 700 ul lyzačního činidla pro okamžité rozrušení a homogenizaci pomocí homogenizéru PRO200 (PRO Scientific). RNA byla eluována ve 30 ul vody bez RNázy. Množství a čistota byly stanoveny pomocí Nanodrop ND-1000.

Test qRT-PCR: Kvantifikace miRNA 1, 10b, 22, 92a a 192 byla provedena, jak je ukázáno: 4 ul celkové RNA byly použity jako templát pro reverzní transkripci miRNA. Reverzní transkripce byla provedena pomocí Universal cDNA Syntéza Kit, (Exiqon): 0,5 ul syntetického miRNA SPIKE (UniSp6) bylo přidáno do každého vzorku pro normalizaci hladin miRNA v plazmě. qPCR v reálném čase byla provedena pomocí ExiLENT SYBR® Green PCR Master Mix a primerů miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR, (Exiqon) pro hsa-miR-1-3p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-22 -3p, hsa-miR-192-5p a hsa-miR-92a-3p. PCR program a analýza disociační křivky byly provedeny v tepelném cyklovači LightCycler Nano (Roche) za podmínek popsaných výrobcem.

Metoda relativní kvantifikace byla validována a kvantifikace miRNA ve skupině všežravců byla provedena pomocí metody 2-ΔACt, použitým normalizátorem byl Spike v UniSp6 a kalibrátorem byla průměrná hodnota ΔCt kontrolní skupiny v každém časovém bodě (0 2, 4 a 6 hodin). Spike v UniSp6 byl použit jako normalizátor kvůli nedostatku endogenních kontrol zavedených pro normalizaci ve vzorcích séra a plazmy. Každý vzorek byl analyzován trojmo, včetně Spike v UniSp6 a negativních kontrol. Data byla získána pro kvantitativní detekci miRNA v plazmě po jídle s hovězím masem ve srovnání s kontrolní skupinou (veganské jídlo).

Analýza dat: Normální distribuce miRNA byla stanovena Kolmogorov-Smirnov testem. Deskriptivní statistika byla provedena s hodnotami 2-AACt obou studijních skupin v každém čase odběru (0, 2, 4 a 6 h). Diferenciální detekce miRNA mezi všežravcem a kontrolní skupinou byla hodnocena t-studentským testem v různých postprandiálních časových bodech a porovnána s detekcí nalačno pomocí testu ANOVA. Byly provedeny Pearsonovy korelace pro spojení hladin miRNA s kontrolní nebo všežravou stravou. Analýza byla provedena s použitím IBM SPSS Statistics 20 a rozdíly byly považovány za významné, pokud p <0,05.