Vliv biologických látek na alternativní funkce eozinofilů u těžkého astmatu

Těžké astma je pozorováno u 3 až 5 % astmatické populace a je charakterizováno vyšším počtem exacerbací, špatně kontrolovaným astmatem a/nebo špatnou funkcí plic. Během posledních deseti let anti-IgE a anti-IL5 (a anti-IL5R) výrazně zlepšily stav těžkého astmatu. Léčba chronickými nebo perorálními kortikosteroidy je skutečně zodpovědná za mnoho vedlejších účinků. Existuje však nedostatek biomarkerů pro predikci odpovědí na anti-IL5 a anti-IgE.

Již dříve jsme zjistili, že počty eozinofilů ve sputu jsou dobrými prediktory pro zlepšení funkce plic u těžkých astmatiků pomocí anti-IL5 (Schleich et al, v tisku v Clin Exp Allergy 2020). Buňky sputa nemusí být jediným relevantním markerem sputa pro pacienty reagující na mepolizumab.

Cílem je vyhodnotit schopnost cytokinů sputa (hladiny a geny proteinů) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 a GM-CSF) predikovat odpověď těžkých astmatiků po 6. měsíce léčby biologickými přípravky ve smyslu snížení exacerbací a užívání kortikosteroidů, zlepšení FEV1, kontroly astmatu, kvality života astmatu a vlivu na sputum a zánět krve.

Závažní astmatici pozorovaní na Klinice astmatu v CHU v Lutychu jsou velmi dobře charakterizováni pomocí základního měření krevních vzorků, indukovaného sputa, plicních funkcí, FeNO, dotazníků kontroly astmatu (ACT - ACQ) a dotazníků kvality života astmatu (AQLQ).

Zaznamenávány jsou také údaje o exacerbacích během předchozího roku a aktuální inhalační a perorální léčbě. Je-li hodnota FEV1 vyšší než 70 % předpokládané hodnoty, provádějí těžcí astmatici také metacholinovou provokaci, aby zhodnotili bronchiální hyperreaktivitu.

Všechna tato opatření se opakují po 6 měsících léčby mepolizumabem. Všechny supernatanty sputa jsou skladovány při -80 °C a k dispozici je také RNA z buněk sputa.

Cílová velikost vzorku: 50 pacientů

Plánujeme měřit různé cytokiny ve sputu (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) a vyhodnotit jejich schopnost predikovat odpověď po 6 měsících léčby různými biologickými přípravky z hlediska snížení exacerbací a užívání kortikosteroidů, zlepšení FEV1 (+200 ml), kontrola astmatu (snížení ACQ >0,5, zvýšení ACT >3), kvalita života astmatu (zvýšení skóre AQLQ > 0,5) a vliv na sputum a krev zánět.

Astmatickí pacienti jsou získáváni prostřednictvím ambulance a centra plicní rehabilitace (CHU, Sart-Tilman, Liege). Astma je diagnostikováno tak, jak je popsáno v pokynech GINA (http://ginasthma.org/).

Indukce a zpracování sputa. Sputum je indukováno a zpracováno, jak bylo popsáno dříve (Delvaux Thorax 2014). Celé sputum se shromáždí v plastové nádobě, zváží se a homogenizuje se třemi objemy fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS), vortexuje se po dobu 30 s a centrifuguje se při 800 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Supernatant se oddělí od buňky peletu filtrací přes 2 vrstvy sterilní gázy. Provede se mukolýza přidáním stejného objemu 6,5 mM dithiothreitolu a suspenze se třepe po dobu 20 minut. Po centrifugaci po dobu 10 minut při 550 g se zkontrolují dlaždicové buňky a celkový počet buněk, jakož i životaschopnost buněk vyloučením trypanové modři pomocí ručního hemocytometru. Diferenciální počet leukocytů se provádí na cytospinech obarvených May-Grünwald-Giemsa na 500 buňkách.

Pokud jsou dodržena kritéria kvality (< 30 % dlaždicových buněk a životaschopnost > 50 %), buněčná peleta se smíchá s 5 objemy RNAprotect buněčného činidla (Qiagen, Hilden, Německo) a udržuje se při -80 °C až do extrakce RNA.

Celkem bude analyzováno 50 pacientů s úspěšně indukovanými vzorky supernatantu sputa před anti-IL-5, anti-IL5R nebo anti-IgE terapií a také 6 měsíců poté. Pokud jde o buňky sputa, pacienti s kvalitními vzorky před a po terapii umožní analýzu genové exprese.

Imunotesty: Koncentrace mediátorů obsažených v supernatantu sputa jsou hodnoceny testem výkonu ELISA Luminex (R and D systems, Minneapolis, USA) podle pokynů výrobce. Provádějí se experimenty s nástřikem cytokinů v supernatantech sputa, aby se ověřilo, že výtěžek je mezi 80 % a 120 % pro všechny analyty.

Metody extrakce RNA a RT-qPCR Hladiny mediátorového proteinu budou získány pomocí Luminex performance XL discovery kit (R and D systems, Minneapolis, USA) pro IL-3 a IL-4 (detekční limit: 0,09 pg/ml pro oba). Pro IL-5, IL-13, IL-33 a GM-CSF bude použita souprava Luminex s vysokou citlivostí. Detekční limity jsou 0,4, 5,1, 1,8 a 1,6 pg/ml.

Pokud jde o úrovně exprese mediátorového genu, budou kroky provedeny přesně tak, jak bylo nedávno popsáno. Primery a sondy budou všechny získány od IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). Účinnost PCR bude vypočítána pomocí softwaru pro analýzu qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgie). Stejný program bude použit pro získání relativní kvantifikace v genové expresi metodou 2-∆∆Ct. HPRT1 a GNB2L1 budou použity jako referenční geny, jak bylo také uvedeno dříve. Pacienti budou porovnáni s kohortou 7 zdravých subjektů.

Tyto kroky se provádějí podle popisu da Silva et al [Clin Exp alergie 2017] kromě toho, že krok Taqman PCR se provádí v 96jamkových destičkách a že pro každý vzorek se použijí 2 µl cDNA (zředěné 1:4). v celkovém reakčním objemu 12,5 ul včetně 500 nM dopředného primeru, 500 nM reverzního primeru a 250 nM sondy pro všechny testované geny. Každá qPCR je provedena v duplikátech a zahrnuje kontroly bez šablony pro každý gen. Amplifikace se provádí na LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) během 45 cyklů následovně: počáteční aktivační krok: 95 °C po dobu 15 minut; denaturační stupeň: 94 °C po dobu 15 s; fáze žíhání a prodloužení: 60 °C po dobu 1 min. Primery a sondy jsou všechny označeny reportérem a dvojitým zhášecím barvivem 5'6-karboxyfluorescein/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) a byly získány od IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , IL, USA). Pro každý gen se vytvoří standardní křivky s použitím 4násobného sériového ředění zásobní cDNA (soubor 4 cDNA), aby se ověřilo, že všechny získané účinnosti PCR jsou mezi 1,9 a 2,1. Kontaminace genomové DNA je kontrolována provedením qPCR s každým vzorkem RNA bez kroku RT. Relativní kvantifikace v genové expresi je stanovena pomocí softwaru pro analýzu qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgie) pomocí metody 2-∆∆Ct. HPRT1 a GNB2L1 se používají jako referenční geny, jak bylo dříve určeno. Veškerý postup se provádí podle pokynů MIQE pro minimální informace požadované pro experiment qPCR.

Cytokiny budou také měřeny v krvi podskupiny pacientů.

Koncové body studie

Primární koncový bod:

Identifikovat prediktory snížení exacerbací a dávky perorálních kortikosteroidů.

Sekundární koncový bod:

K identifikaci prediktorů zlepšení ACQ (-0,5), ACT (+3 body), AQLQ (+ 0,5), eozinofily ve sputu (<3 %), FEV1 (+ 200 ml).

Statistický plán nebo analýza dat Výsledky budou vyjádřeny jako průměr ¡SD nebo střední ¡SEM pro spojité proměnné; medián (rozsah) pro zkreslená rozdělení. U kategoriálních proměnných bude v každé kategorii uveden počet pozorování a procenta. Porovnání mezi různými podskupinami bude provedeno Kruskal-Wallisovým testem nebo párovým t-testem / Wilcoxonovým znaménkovým rank testem. Pro měření asociace mezi klinickými parametry bude použit Spearmanův korelační koeficient.

Výpočty síly ukázaly požadovanou celkovou velikost vzorku 50 subjektů k potvrzení změny ve výsledcích.