Virkning af biologiske stoffer på alternative funktioner af eosinofiler ved svær astma

Svær astma ses hos 3 til 5 % af den astmatiske befolkning og er karakteriseret ved en højere frekvens af eksacerbationer, dårligt kontrolleret astma og/eller dårlig lungefunktion. I løbet af de sidste ti år har anti-IgE og anti-IL5 (og anti-IL5R) forbedret alvorlig astmastatus betydeligt. Behandling med kronisk eller oral kur af kortikosteroider er faktisk ansvarlig for en masse bivirkninger. Der er imidlertid mangel på biomarkører til forudsigelse af respondere på anti-IL5 og anti-IgE.

Vi har tidligere fundet ud af, at sputum-eosinofiltal er gode prædiktorer for forbedring af lungefunktionen hos svære astmatikere ved brug af anti-IL5 (Schleich et al., under tryk i Clin Exp Allergy 2020). Sputumceller er muligvis ikke den eneste relevante sputummarkør for respondere på mepolizumab.

Formålet er at evaluere evnen af ​​sputumcytokiner (proteinniveauer og gener) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 og GM-CSF) til at forudsige responsen hos svære astmatikere efter 6. måneders behandling med biologiske lægemidler i form af reduktion af eksacerbationer og kortikosteroidbrug, forbedring af FEV1, i astmakontrol, i astma-livskvalitet og effekt på sputum og blodbetændelse.

Svære astmatikere set i astmaklinikken i CHU i Liege er meget velkarakteriseret ved hjælp af baseline-måling af blodprøver, induceret opspyt, lungefunktion, FeNO, astmakontrolspørgeskemaer (ACT - ACQ) og astma-livskvalitetsspørgeskemaer (AQLQ).

Data om eksacerbationer i løbet af det foregående år og nuværende inhalations- og oralbehandling registreres også. Hvis FEV1-værdien er højere end 70 % af den forudsagte værdi, udfører svære astmatikere også en metacholin-udfordring for at evaluere bronkial hyperresponsivitet.

Alle disse tiltag gentages efter 6 måneders behandling med mepolizumab. Alle sputumsupernatanterne opbevares ved -80°C, og RNA fra sputumceller er også tilgængelig.

Målstikprøvestørrelse: 50 patienter

Vi planlægger at måle forskellige cytokiner i sputum (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4...) og at evaluere deres evne til at forudsige responsen efter 6 måneders behandling med forskellige biologiske midler mht. reduktion i eksacerbationer og kortikosteroidbrug, forbedring af FEV1 (+200 ml), i astmakontrol (ACQ-fald >0,5, ACT-stigning >3), i astma-livskvalitet (stigning i AQLQ-score > 0,5) og virkningen på opspyt og blod betændelse.

Astmatiske patienter rekrutteres gennem ambulatoriet og lungerehabiliteringscentret (CHU, Sart-Tilman, Liege). Astma diagnosticeres som beskrevet i GINA-retningslinjerne (http://ginasthma.org/).

Sputum induktion og behandling. Sputumet induceres og behandles som tidligere beskrevet (Delvaux Thorax 2014). Hele sputum opsamles i en plastikbeholder, vejes og homogeniseres med tre volumener phosphatbufret saltvand (PBS), vortexes i 30 s og centrifugeres ved 800 g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten adskilles fra cellen pellet ved filtrering gennem 2 lag steril gaze. En mucolyse udføres ved at tilsætte et lige så stort volumen af ​​6,5 mM dithiothreitol, og suspensionen rystes i løbet af 20 min. Efter en centrifugering på 10 min ved 550 g kontrolleres pladecellecellerne og det samlede celletal samt cellelevedygtigheden ved trypanblåt udelukkelse med et manuelt hæmocytometer. Den differentielle leukocyttælling udføres på cytospin farvet med May-Grünwald-Giemsa på 500 celler.

Hvis kvalitetskriterierne (< 30 % af pladecelleceller og levedygtighed > 50 %) overholdes, blandes cellepelleten med 5 volumener RNAprotect-cellereagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) og holdes ved -80 °C indtil RNA-ekstraktion.

I alt vil 50 patienter med vellykkede inducerede sputumsupernatantprøver før anti-IL-5, anti-IL5R eller anti-IgE-behandling samt 6 måneder efter blive analyseret. Hvad angår sputumcellerne, vil patienter med prøver af god kvalitet før og efter terapi tillade genekspressionsanalyse.

Immunoassays: Koncentrationerne af mediatorerne indeholdt i sputumsupernatanten vurderes ved ELISA Luminex performance assay (R- og D-systemer, Minneapolis, USA) i henhold til producentens instruktioner. Spiking-eksperimenter med cytokiner i sputumsupernatanter udføres for at kontrollere, at genvindingen er mellem 80 % og 120 % for alle analytterne.

RNA-ekstraktion og RT-qPCR-metoder Mediatorproteinniveauerne vil blive opnået ved hjælp af Luminex performance XL discovery kit (R- og D-systemer, Minneapolis, USA) for IL-3 og IL-4 (detektionsgrænse: 0,09 pg/ml for begge). Et Luminex high sensitivity performance kit vil blive brugt til IL-5, IL-13, IL-33 og GM-CSF. Detektionsgrænser er henholdsvis 0,4, 5,1, 1,8 og 1,6 pg/ml.

Med hensyn til mediatorgenekspressionsniveauerne vil trinene blive udført nøjagtigt som beskrevet for nylig. Primere og prober vil alle fås fra IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). PCR-effektivitet vil blive beregnet ved hjælp af qbase+ qPCR-analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien). Det samme program vil blive brugt til at opnå relativ kvantificering i genekspression ved hjælp af 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 og GNB2L1 vil blive brugt som referencegener som også tidligere rapporteret. Patienterne vil blive sammenlignet med en kohorte på 7 raske forsøgspersoner.

Disse trin udføres i henhold til beskrivelsen af ​​da Silva et al [Clin Exp allergi 2017] bortset fra, at Taqman PCR-trinnet udføres i 96-brønds plader, og at der for hver prøve anvendes 2 µl cDNA (fortyndet 1:4) i et totalt reaktionsvolumen på 12,5 µl inklusive 500 nM fremadgående primer, 500 nM revers primer og 250 nM probe for alle de testede gener. Hver qPCR realiseres i to eksemplarer og inkluderede ikke-skabelonkontroller for hvert gen. Amplifikation udføres på LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) i løbet af 45 cyklusser som følger: indledende aktiveringstrin: 95 °C i 15 min; denatureringstrin: 94 °C i 15 s; udglødnings- og forlængelsestrin: 60 °C i 1 min. Primere og prober er alle mærket med reporter og double-quencher farvestoffer 5'6-carboxyfluorescein/ZEN/3' Iowa sort FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) og blev opnået fra IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie) IL, USA). Standardkurver genereres for hvert gen under anvendelse af en 4 gange seriel fortynding af stam-cDNA (pulje af 4 cDNA) for at kontrollere, at alle opnåede PCR-effektiviteter er mellem 1,9 og 2,1. Genomisk DNA-kontamination kontrolleres ved at udføre qPCR med hver RNA-prøve uden RT-trin. Relativ kvantificering i genekspression bestemmes ved hjælp af qbase+ qPCR-analysesoftware (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien) ved hjælp af 2-∆∆Ct-metoden. HPRT1 og GNB2L1 bruges som referencegener som tidligere bestemt. Hele proceduren udføres i henhold til MIQE-retningslinjerne for den mindste information, der kræves til et qPCR-eksperiment.

Cytokiner vil også blive målt i blodet hos en undergruppe af patienter.

Undersøgelses endepunkter

Primært endepunkt:

At identificere prædiktorer for reduktion i eksacerbationer og i orale kortikosteroiddoser.

Sekundært endepunkt:

For at identificere prædiktorer for forbedring i ACQ (-0,5), ACT (+3pts), AQLQ (+ 0,5), sputum eosinofiler (<3%), FEV1 (+ 200ml).

Statistisk plan eller dataanalyse Resultaterne vil blive udtrykt som middel¡SD eller middel¡SEM for kontinuerte variable; median (interval) for skæve fordelinger. For kategoriske variable vil antallet af observationer og procenter være angivet i hver kategori. Sammenligninger mellem forskellige undergrupper vil blive udført med en Kruskal-Wallis test eller parret t-test / Wilcoxon signed rank test. Spearman-korrelationskoefficienten vil blive brugt til at måle sammenhængen mellem kliniske parametre.

Effektberegninger indikerede en påkrævet samlet prøvestørrelse på 50 forsøgspersoner for at bekræfte en ændring i resultaterne.