Effetto dei prodotti biologici sulle funzioni alternative degli eosinofili nell'asma grave

L'asma grave si osserva nel 3-5% della popolazione asmatica ed è caratterizzato da un più alto tasso di riacutizzazioni, asma scarsamente controllato e/o scarsa funzionalità polmonare. Negli ultimi dieci anni, anti-IgE e anti-IL5 (e anti-IL5R) hanno notevolmente migliorato lo stato di asma grave. Il trattamento con un ciclo cronico o orale di corticosteroidi è infatti responsabile di molti effetti collaterali. Vi è tuttavia una mancanza di biomarcatori per la previsione dei responder all'anti-IL5 e all'anti-IgE.

In precedenza abbiamo scoperto che la conta degli eosinofili nell'espettorato è un buon predittore del miglioramento della funzionalità polmonare degli asmatici gravi utilizzando l'anti-IL5 (Schleich et al, in press in Clin Exp Allergy 2020). Le cellule dell'espettorato potrebbero non essere l'unico marker dell'espettorato rilevante per i responder al mepolizumab.

L'obiettivo è valutare la capacità delle citochine dell'espettorato (livelli proteici e geni) (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-33 e GM-CSF) di predire la risposta degli asmatici gravi dopo 6 mesi di trattamento con farmaci biologici in termini di riduzione delle riacutizzazioni e dell'uso di corticosteroidi, miglioramento del FEV1, controllo dell'asma, qualità della vita dell'asma ed effetto sull'espettorato e sull'infiammazione del sangue.

Gli asmatici gravi osservati nella Clinica per l'Asma del CHU di Liegi sono molto ben caratterizzati utilizzando la misurazione basale di campioni di sangue, espettorato indotto, funzionalità polmonare, FeNO, questionari per il controllo dell'asma (ACT - ACQ) e questionari sulla qualità della vita dell'asma (AQLQ).

Vengono inoltre registrati i dati sulle riacutizzazioni durante l'anno precedente e sul trattamento inalatorio e orale in corso. Se il valore del FEV1 è superiore al 70% del valore predetto, gli asmatici gravi eseguono anche un test con metacolina per valutare l'iperreattività bronchiale.

Tutte queste misure vengono ripetute dopo 6 mesi di trattamento con mepolizumab. Tutti i surnatanti dell'espettorato vengono conservati a -80°C ed è disponibile anche l'RNA delle cellule dell'espettorato.

Dimensione del campione target: 50 pazienti

Intendiamo misurare diverse citochine nell'espettorato (IL3, GM-CSF, IL5, IL-13, IL-33, IL-4…) e valutare la loro capacità di predire la risposta dopo 6 mesi di trattamento con diversi biologici in termini di riduzione delle riacutizzazioni e dell'uso di corticosteroidi, miglioramento del FEV1 (+200 ml), del controllo dell'asma (diminuzione dell'ACQ >0,5, aumento dell'ACT >3), della qualità della vita dell'asma (aumento del punteggio AQLQ >0,5) e dell'effetto sull'espettorato e sul sangue infiammazione.

I pazienti asmatici vengono reclutati attraverso l'ambulatorio e il centro di riabilitazione polmonare (CHU, Sart-Tilman, Liegi). L'asma viene diagnosticato come descritto nelle linee guida GINA (http://ginasthma.org/).

Induzione ed elaborazione dell'espettorato. L'espettorato viene indotto ed elaborato come descritto in precedenza (Delvaux Thorax 2014). L'intero espettorato viene raccolto in un contenitore di plastica, pesato e omogeneizzato con tre volumi di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), vortexato per 30 s e centrifugato a 800 g per 10 min a 4° C. Il surnatante viene separato dalla cellula pellet per filtrazione attraverso 2 strati di garza sterile. Viene eseguita una mucolisi aggiungendo un volume uguale di 6,5 mM ditiotreitolo e la sospensione viene agitata per 20 min. Dopo una centrifugazione di 10 minuti a 550 g, le cellule squamose e la conta cellulare totale, nonché la vitalità cellulare, vengono controllate mediante esclusione del tripan blu con un emocitometro manuale. La conta leucocitaria differenziale viene eseguita su cytospin colorati con May-Grünwald-Giemsa su 500 cellule.

Se i criteri di qualità (< 30% di cellule squamose e vitalità > 50%) vengono rispettati, il pellet cellulare viene miscelato con 5 volumi di reagente cellulare RNAprotect (Qiagen, Hilden, Germania) e mantenuto a -80 ° C fino all'estrazione dell'RNA.

In totale, verranno analizzati 50 pazienti con campioni surnatanti di espettorato indotti con successo prima della terapia anti-IL-5, anti-IL5R o anti-IgE e 6 mesi dopo. Per quanto riguarda le cellule dell'espettorato, i pazienti con campioni di buona qualità prima e dopo la terapia consentiranno l'analisi dell'espressione genica.

Dosaggi immunologici: le concentrazioni dei mediatori contenuti nel supernatante dell'espettorato sono valutate mediante saggio di performance ELISA Luminex (sistemi R e D, Minneapolis, USA) secondo le istruzioni del produttore. Vengono eseguiti esperimenti di spiking di citochine nei supernatanti dell'espettorato per verificare che il recupero sia compreso tra l'80% e il 120% per tutti gli analiti.

Estrazione dell'RNA e metodi RT-qPCR I livelli della proteina mediatrice saranno ottenuti utilizzando il kit di scoperta Luminex performance XL (sistemi R e D, Minneapolis, USA) per IL-3 e IL-4 (limite di rilevazione: 0.09 pg/ml per entrambi). Verrà utilizzato un kit di prestazioni ad alta sensibilità Luminex per IL-5, IL-13, IL-33 e GM-CSF. I limiti di rilevamento sono rispettivamente di 0,4, 5,1, 1,8 e 1,6 pg/ml.

Per quanto riguarda i livelli di espressione genica del mediatore, i passaggi saranno eseguiti esattamente come descritto di recente. I primer e le sonde saranno tutti ottenuti da IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, USA). Le efficienze della PCR saranno calcolate utilizzando il software di analisi qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgio). Lo stesso programma sarà utilizzato per ottenere la quantificazione relativa dell'espressione genica utilizzando il metodo 2-∆∆Ct. HPRT1 e GNB2L1 saranno usati come geni di riferimento come riportato in precedenza. I pazienti saranno confrontati con una coorte di 7 soggetti sani.

Questi passaggi vengono eseguiti secondo la descrizione di da Silva et al [Clin Exp allergy 2017] tranne per il fatto che il passaggio Taqman PCR viene eseguito in piastre da 96 pozzetti e che per ciascun campione vengono utilizzati 2 µl di cDNA (diluito 1:4) in un volume di reazione totale di 12,5 µl inclusi primer forward da 500 nM, primer reverse da 500 nM e sonda da 250 nM per tutti i geni testati. Ogni qPCR è realizzato in duplicato e include controlli non templati per ciascun gene. L'amplificazione viene eseguita su LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Pleasanton, CA, USA) durante 45 cicli come segue: fase di attivazione iniziale: 95 ° C per 15 min; fase di denaturazione: 94 °C per 15 s; fase di ricottura e allungamento: 60 °C per 1 min. I primer e le sonde sono tutti etichettati con coloranti reporter e double-quencher 5'6-carbossifluoresceina/ZEN/3' Iowa black FQ (5'6-FAM/ZEN/3'IBFQ) e sono stati ottenuti da IDT (Integrated DNA Technologies, Skokie , IL, USA). Le curve standard vengono generate per ciascun gene utilizzando una diluizione seriale 4 volte del cDNA stock (pool di 4 cDNA) per verificare che tutte le efficienze PCR ottenute siano comprese tra 1,9 e 2,1. La contaminazione del DNA genomico è controllata eseguendo qPCR con ogni campione di RNA senza passaggio RT. La quantificazione relativa nell'espressione genica viene determinata utilizzando il software di analisi qbase+ qPCR (Biogazelle, Zwijnaarde, Belgio) utilizzando il metodo 2-∆∆Ct. HPRT1 e GNB2L1 sono usati come geni di riferimento come precedentemente determinato. Tutta la procedura viene eseguita secondo le linee guida MIQE per le informazioni minime richieste per un esperimento qPCR.

Le citochine saranno misurate anche nel sangue di un sottogruppo di pazienti.

Endpoint dello studio

Punto finale principale:

Identificare i predittori di riduzione delle riacutizzazioni e della dose di corticosteroidi orali.

Endpoint secondario:

Per identificare i predittori di miglioramento in ACQ (-0,5), ACT (+3 punti), AQLQ (+ 0,5), eosinofili nell'espettorato (<3%), FEV1 (+ 200 ml).

Piano statistico o analisi dei dati I risultati saranno espressi come media¡SD o media¡SEM per variabili continue; mediana (intervallo) per distribuzioni asimmetriche. Per le variabili categoriali, il numero di osservazioni e le percentuali saranno fornite in ciascuna categoria. I confronti tra diversi sottogruppi saranno eseguiti con un test di Kruskal-Wallis o un paired t-test / Wilcoxon Signed rank test. Il coefficiente di correlazione di Spearman sarà utilizzato per misurare l'associazione tra i parametri clinici.

I calcoli di potenza hanno indicato una dimensione totale del campione richiesta di 50 soggetti per confermare un cambiamento nei risultati.