Molekulární mikrobiologie při osteoartritidové infekci (MOLOS)

Východiska: Osteoartikulární infekce jsou bolestivá a invalidizující onemocnění, která vyžadují antimikrobiální léčbu přizpůsobenou příslušným mikroorganismům. Mikrobiologické kultury jsou v současné době považovány za referenční pro identifikaci patogenních bakterií a zdá se, že mikrobiologické kultury jsou ve většině případů dostatečné pro stanovení diagnózy. Citlivost těchto kultur je však velmi variabilní a závisí jak na kontextu, ve kterém jsou klinické vzorky odebírány, tak na příslušném patogenu. Předchozí experimentální data navíc ukazují, že molekulární metody by mohly poskytnout diagnózu, která konvenčním kulturám chybí. Hlavní cíl: Cílem studie je zhodnotit diagnostické výkony mikrobiologických kultur a molekulární metody tím, že se pro definici případů zohlední akumulace klinických, radiologických a biologických argumentů obvykle používaných ke stanovení diagnózy kostních a kloubních infekcí. Nesoulad obou metod bude druhotně klasifikován expertní skupinou osteoartikulární infekce (složenou z bakteriologa, radiologa, chirurga, anatomického patologa a revmatologa). Testovaná hypotéza: Zájem molekulárních metod pro diagnostiku osteoartikulárních onemocnění infekcí. Sekundární cíl:Kvantifikace zpoždění výsledků získaných dvěma metodami Design studie: · Jedno centrum specializované na osteoartikulární infekce · Observační prospektivní studie · Dvě metody diagnostiky: kultivace a molekulární metody · Expertní skupina Zahrnutá pacienti a počet pacienti: Celkem 284 pacientů složených ze 194 případů a 90 kontrol Zahrnutí pacienti (n=194) budou mít všichni suspektní diagnózu osteoartikulárních infekcí včetně diskitidy, septické artritidy a protetické kloubní infekce definované kritérii zařazení. Výsledky zařazených pacientů budou porovnány k těm získaným ze skupiny kontrolních pacientů (n=90).Protokol trvání: Délka studie je 6 měsíců pro každého pacientaDélka protokolu je plánována na 2 rokyPostupy:Všechny vzorky budou ošetřeny stejným postupem - Vzorky (synoviální tekutiny, biopsie, ..) budou odebrány buď během operace, punkční aspirací u lůžka, nebo řízenou ultrasonografií, vše za sterilních podmínek (maska, sterilní rukavice, pečlivá příprava kůže a ručník) a převezeny na bakteriologické oddělení ve sterilních zkumavkách bez další substrát za méně než 12 hodin. - Bakteriologické postupy budou prováděny podle směrnic platných pro osteoartikulární infekci · Kapalné vzorky: počty erytrocytů a leukocytů, procento polymorfonukleáru · Pevné vzorky: rozdrcené pomocí mechanického přístroje · Barvení Gramem a auraminem · Kultury při 37°C na Columbia ovčím krevním agaru (aerobně a anaerobně po dobu 5 dnů), čokoládový agar doplněný o IsoVitaleX (s 5 % CO2 po dobu 5 dnů), bujón pro infuzi mozku a srdce (anaerobně po dobu 15 dnů se subkulturami prováděnými po 10 dnech na stejném agarovém médiu, i když nebyl aspekt zataženo).· Mykobakteriální kultura: Lowenstein-Jensen a COLETSOS média, MGIT inkubované po dobu 3 měsíců.- Molekulární postupy · Manipulace s DNA před a po PCR: v oddělených místnostech se samostatnými pipetovacími zařízeními, aby se zabránilo kontaminaci vzorků cizí DNA. · Vybavení používané v krocích pre-PCR: bez DNA a UV zářením. · Extrakce DNA založená na Boomově metodě: QIAGEN kit a EZ1 BioRobot · Široká amplifikace genu 16S rRNA · Amplikony: sekvenované v obou směrech na analyzátoru ABIPRISM 3100 (Applied Bio systems, COURTABOEUF, Francie). · Klonovací experimenty pro několik sekvencí v jednom vzorku · Analýza sekvence: GenBank pomocí programu BLASTN prostřednictvím webových stránek Národního centra biotechnologických informací. Interní kontrolní PCR: b-aktinový gen· Real time PCR: pro detekci mykobakterií a gonokokové artritidy- Potenciální důsledky: Mohli jsme se rozhodnout, jako většina dosud publikovaných studií, porovnat naši molekulární metodu s jinou metodou diagnostiky (kultura, histologie). V současnosti však neexistuje zlatý standard a diagnostika osteoartikulárních infekcí obecně spočívá na hromadění argumentů. Pravidlem expertní skupiny je s menším možným omylem určit, zda bude každý zahrnutý pacient „infikován“. Tato metodika je blízká každodenní klinické realitě a důvěřuje lékaři, který pacienta ošetřoval. Pokud studie prokáže výhodu molekulární biologie oproti klasickým metodám v našich souborech, bylo by opodstatněné diskutovat o diagnostickém diagramu osteoartikulárních infekcí.