Microbiologia molecolare nell'infezione da osteoartrite (MOLOS)

Sfondo: Le infezioni osteoarticolari sono malattie dolorose e invalidanti che richiedono un trattamento antimicrobico adattato ai microrganismi coinvolti. Le colture microbiologiche sono attualmente considerate il riferimento per l'identificazione di batteri patogeni e sembra che le colture microbiologiche siano sufficienti nella maggior parte dei casi per stabilire la diagnosi. Tuttavia, la sensibilità di queste colture è molto variabile e dipende sia dal contesto in cui vengono prelevati i campioni clinici, sia dal patogeno coinvolto. Inoltre, precedenti dati sperimentali mostrano che i metodi molecolari potrebbero produrre una diagnosi mancante nelle colture convenzionali. Obiettivo principale: Lo scopo dello studio è valutare le prestazioni diagnostiche delle colture microbiologiche e del metodo molecolare considerando per la definizione dei casi un accumulo di argomenti clinici, radiologici e biologici solitamente utilizzati per stabilire la diagnosi di infezioni ossee e articolari. La discordanza delle due metodiche sarà secondariamente classificata da un gruppo di esperti di infezione osteoarticolare (composto da un batteriologo, un radiologo, un chirurgo, un anatomo-patologo e un reumatologo). Ipotesi verificata: Interesse delle metodiche molecolari per la diagnosi delle infezioni.Obiettivo secondario: Quantificazione del ritardo dei risultati ottenuti dai due metodi Disegno dello studio: · Un centro specializzato in infezioni osteoarticolari· Studio osservazionale prospettico· Due metodi di diagnosi: colture e metodi molecolari· Un gruppo di esperti Pazienti inclusi e numero di pazienti: totale di 284 pazienti composti da 194 casi e 90 controlliI pazienti inclusi (n=194) avranno tutti una diagnosi sospetta di infezioni osteoarticolari incluse discite, artrite settica e infezione dell'articolazione protesica definita dai criteri di inclusione. Verranno confrontati i risultati dei pazienti inclusi a quelli ottenuti dal gruppo di pazienti di controllo (n=90). Protocollo di durata: La durata dello studio è di 6 mesi per ogni paziente La durata del protocollo è prevista per 2 anni Procedure: Tutti i campioni saranno trattati con la stessa procedura - Campioni (liquidi sinoviali, biopsie, ..) saranno recuperati o durante l'intervento chirurgico, mediante aspirazione per puntura al letto del paziente, o mediante ecografia guidata, il tutto in condizioni sterili (mascherina, guanti sterili, accurata preparazione della pelle e asciugamano) e trasportati al reparto di batteriologia in provette sterili senza substrato aggiuntivo in meno di 12 ore. - Le procedure batteriologiche saranno eseguite secondo le linee guida applicate per le infezioni osteoarticolari · Campioni liquidi: conta di eritrociti e leucociti, percentuale di polimorfonucleati · Campioni solidi: frantumati con apparecchiatura meccanica · Colorazione di Gram e auramina · Colture a 37°C su agar sangue di montone Columbia (aerobico e anaerobico per 5 giorni), agar cioccolato integrato con IsoVitaleX (con 5% CO2 per 5 giorni), brodo brain heart infusion (anaerobico per 15 giorni con sottocolture effettuate dopo 10 giorni sullo stesso terreno agar, anche se l'aspetto non era nuvoloso).· Coltura micobatterica: terreno Lowenstein-Jensen e COLETSOS, MGIT incubato per 3 mesi.- Procedure molecolari · Manipolazioni del DNA pre e post-PCR: in stanze separate con dispositivi di pipettaggio separati per prevenire la contaminazione dei campioni con DNA estraneo. · Attrezzatura utilizzata nelle fasi pre-PCR: priva di DNA e irradiata con raggi UV. · Estrazione del DNA basata sul metodo Boom: kit QIAGEN e EZ1 BioRobot · Amplificazione del gene 16S rRNA ad ampio raggio · Ampliconi: sequenziati in entrambe le direzioni su un analizzatore ABIPRISM 3100 (Applied Bio systems, COURTABOEUF, Francia). · Esperimenti di clonazione per diverse sequenze in un campione· Analisi della sequenza: GenBank utilizzando il programma BLASTN attraverso il sito Web del National Center of Biotechnology Information.· PCR di controllo interno: gene b-actina · PCR in tempo reale: per la rilevazione di micobatteri e artrite gonococcica- Potenziali implicazioni: avremmo potuto scegliere, come la maggior parte degli studi pubblicati fino ad oggi, di confrontare il nostro metodo molecolare con un altro metodo di diagnosi (cultura, istologia). Tuttavia, attualmente non esiste un gold standard e la diagnosi di infezioni osteoarticolari si basa generalmente su un accumulo di argomentazioni. La regola del gruppo di esperti è determinare, con il minor errore possibile, se ogni paziente incluso sarà "infetto". Questa metodologia è vicina alla realtà clinica quotidiana e si fida del medico che ha in cura il paziente. Se lo studio mostra un vantaggio della biologia molecolare rispetto ai metodi classici nei nostri gruppi, allora sarebbe giustificato discutere il diagramma diagnostico delle infezioni osteoarticolari.