Mikrobiologia molekularna w zakażeniu chorobą zwyrodnieniową stawów (MOLOS)

Tło: Infekcje kostno-stawowe są bolesnymi i upośledzającymi chorobami, które wymagają leczenia przeciwbakteryjnego dostosowanego do zaangażowanych mikroorganizmów. Kultury mikrobiologiczne są obecnie uważane za punkt odniesienia w identyfikacji bakterii chorobotwórczych i wydaje się, że w większości przypadków są one wystarczające do ustalenia rozpoznania. Jednak czułość tych kultur jest bardzo zmienna i zależy zarówno od kontekstu, w jakim pobierane są próbki kliniczne, jak i od zaangażowanego patogenu. Ponadto wcześniejsze dane eksperymentalne pokazują, że metody molekularne mogą postawić diagnozę, której brakuje w konwencjonalnych hodowlach. Cel główny: Celem pracy jest ocena skuteczności diagnostycznej posiewów mikrobiologicznych i metody molekularnej poprzez uwzględnienie w definiowaniu przypadków nagromadzenia argumentów klinicznych, radiologicznych i biologicznych zwykle używanych do ustalenia rozpoznania infekcji kości i stawów. Niezgodność obu metod zostanie wtórnie sklasyfikowana przez grupę ekspertów ds. infekcji kostno-stawowych (składającą się z bakteriologa, radiologa, chirurga, anatomio-patologa i reumatologa). Testowana hipoteza: Zainteresowanie metodami molekularnymi w diagnostyce zmian kostno-stawowych infekcje. Cel dodatkowy: Kwantyfikacja opóźnienia wyników uzyskanych dwiema metodami. Projekt badania: · Jeden ośrodek specjalizujący się w zakażeniach kostno-stawowych. · Prospektywne badanie obserwacyjne. · Dwie metody diagnozy: posiewy i metody molekularne. pacjenci: Łącznie 284 pacjentów składających się z 194 przypadków i 90 kontroli. U wszystkich włączonych pacjentów (n=194) będzie podejrzewane zakażenie kości i stawów, w tym zapalenie krążka międzykręgowego, septyczne zapalenie stawów i zakażenie protezy stawu, określone na podstawie kryteriów włączenia. Wyniki włączonych pacjentów zostaną porównane do tych uzyskanych od grupy pacjentów kontrolnych (n=90).Protokół czasu trwania: Czas trwania badania wynosi 6 miesięcy dla każdego pacjentaCzas trwania protokołu zaplanowano na 2 lataProcedury:Wszystkie próbki będą traktowane w ten sam sposób - Próbki (płyn maziowy, biopsje, ..) zostaną pobrane albo podczas operacji, przez aspirację punkcyjną przy łóżku chorego, albo przez ultrasonografię pod kontrolą, wszystko w sterylnych warunkach (maska, sterylne rękawiczki, ostrożne przygotowanie skóry i wytarcie ręcznikiem) i przetransportowane na oddział bakteriologii w sterylnych probówkach bez dodatkowe podłoże w mniej niż 12 godzin. - Procedury bakteriologiczne będą wykonywane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi infekcji kostno-stawowych · Próbki płynne: liczba erytrocytów i leukocytów, procent polimorfojąder · Próbki stałe: rozdrobnione za pomocą aparatury mechanicznej · Barwienie Grama i auraminy · Hodowle w temp. 37°C na agarze Columbia z krwią owczą (tlenowe i beztlenowe przez 5 dni), agar czekoladowy uzupełniony IsoVitaleX (z 5% CO2 przez 5 dni), bulion mózgowo-sercowy (beztlenowo przez 15 dni z subkulturami wykonanymi po 10 dniach na tym samym podłożu agarowym, nawet jeśli wygląd nie był pochmurny).· Hodowla prątków: podłoża Lowenstein-Jensen i COLETSOS, MGIT inkubowane przez 3 miesiące. Procedury molekularne · Manipulacje DNA przed i po PCR: w oddzielnych pomieszczeniach z oddzielnymi urządzeniami do pipetowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek obcym DNA. · Sprzęt używany na etapach poprzedzających reakcję PCR: wolny od DNA i napromieniowany UV. · Ekstrakcja DNA w oparciu o metodę Booma: zestaw QIAGEN i EZ1 BioRobot · Amplifikacja genu 16S rRNA o szerokim zakresie · Amplikony: sekwencjonowanie w obu kierunkach na analizatorze ABIPRISM 3100 (Applied Bio systems, COURTABOEUF, Francja). · Eksperymenty z klonowaniem kilku sekwencji w jednej próbce · Analiza sekwencji: GenBank z wykorzystaniem programu BLASTN za pośrednictwem strony internetowej Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej.· Kontrola wewnętrzna PCR: gen b-aktyny · PCR w czasie rzeczywistym: do wykrywania prątków i gonokokowego zapalenia stawów - Potencjalne implikacje: Mogliśmy, podobnie jak większość opublikowanych do tej pory badań, porównać naszą metodę molekularną z inną metodą diagnozy (kultura, histologia). Jednak obecnie nie ma złotego standardu, a diagnoza infekcji kostno-stawowych zasadniczo opiera się na nagromadzeniu argumentów. Zasadą grupy ekspertów jest ustalenie, z mniejszym możliwym błędem, czy każdy włączony pacjent zostanie „zarażony”. Metodologia ta jest bliska codziennej rzeczywistości klinicznej i zaufana lekarzowi, który leczył pacjenta. Jeśli badanie wykaże przewagę biologii molekularnej nad metodami klasycznymi w naszych grupach, wówczas zasadne byłoby omówienie schematu diagnostycznego infekcji kostno-stawowych.