Microbiologia Molecular na Infecção por Osteoartrite (MOLOS)

Introdução: As infecções osteoarticulares são doenças dolorosas e incapacitantes que requerem tratamento antimicrobiano adaptado aos microrganismos envolvidos. As culturas microbiológicas são atualmente consideradas como referência para identificação de bactérias patogênicas e parece que as culturas microbiológicas são suficientes na maioria dos casos para estabelecer o diagnóstico. No entanto, a sensibilidade dessas culturas é muito variável e depende tanto do contexto em que as amostras clínicas são coletadas quanto do patógeno envolvido. Além disso, dados experimentais anteriores mostram que os métodos moleculares podem produzir um diagnóstico ausente por culturas convencionais. Objetivo principal: O objetivo do estudo é avaliar o desempenho diagnóstico das culturas microbiológicas e do método molecular, considerando para a definição de casos um acúmulo de argumentos clínicos, radiológicos e biológicos usualmente utilizados para estabelecer o diagnóstico de infecções ósseas e articulares. A discordância dos dois métodos será classificada secundariamente por um grupo de especialistas em infecção osteoarticular (composto por um bacteriologista, um radiologista, um cirurgião, um anatomopatologista e um reumatologista). Hipótese testada: Interesse dos métodos moleculares para o diagnóstico de osteoarticular infecções.Objetivo secundário:Quantificação do atraso dos resultados obtidos pelos dois métodos Desenho do estudo: · Um centro especializado em infecções osteoarticulares· Estudo prospectivo observacional· Dois métodos de diagnóstico: culturas e métodos moleculares· Um grupo de especialistas Incluiu pacientes e número de pacientes: Total de 284 pacientes composto por 194 casos e 90 controles Os pacientes incluídos (n = 194) terão todos um diagnóstico suspeito de infecções osteoarticulares incluindo discite, artrite séptica e infecção de prótese articular definida por critérios de inclusão. Os resultados dos pacientes incluídos serão comparados aos obtidos do grupo de pacientes controle (n=90).Protocolo de duração: A duração do estudo é de 6 meses para cada pacienteA duração do protocolo está prevista para 2 anosProcedimentos:Todas as amostras serão tratadas com o mesmo procedimento - Amostras (líquidos sinoviais, biópsias, ..) serão recuperados durante a cirurgia, por punção aspirativa à beira do leito, ou por ultrassonografia guiada, todos em condições estéreis (máscara, luvas estéreis, preparação cuidadosa da pele e toalha) e transportados para o departamento de Bacteriologia em tubos estéreis sem substrato adicional em menos de 12 horas. - Os procedimentos bacteriológicos serão realizados de acordo com as diretrizes aplicadas para infecção osteoarticular · Amostras líquidas: contagem de eritrócitos e leucócitos, porcentagem de polimorfonucleares · Espécimes sólidos: esmagados com um aparelho mecânico · Coloração de Gram e auramina· Culturas a 37°C em ágar sangue de ovelha Columbia (aeróbio e anaerobicamente por 5 dias), ágar chocolate suplementado com IsoVitaleX (com 5% CO2 por 5 dias), caldo cérebro coração infusão (anaerobicamente por 15 dias com subcultivos feitos após 10 dias no mesmo meio de ágar, mesmo que o aspecto não tenha sido nublado).· Cultura micobacteriana: Meio Lowenstein-Jensen e COLETSOS, MGIT incubado por 3 meses.- Procedimentos moleculares· Manipulações de DNA pré e pós-PCR: em salas separadas com dispositivos de pipetagem separados para evitar a contaminação das amostras com DNA estranho. · Equipamento utilizado nas etapas pré-PCR: livre de DNA e irradiado com UV. · Extração de DNA com base no método de Boom: kit QIAGEN e EZ1 BioRobot · Amplificação do gene 16S rRNA de amplo alcance · Amplicons: sequenciados em ambas as direções em um analisador ABIPRISM 3100 (Applied Bio systems, COURTABOEUF, França). · Experimentos de clonagem de várias seqüências em uma amostra· Análise de seqüência: GenBank usando o programa BLASTN através do site do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia.· PCR de controle interno: gene da b-actina· PCR em tempo real: para a detecção de micobactérias e artrite gonocócica- Potenciais implicações: Poderíamos ter escolhido, como a maioria dos estudos publicados até agora, comparar nosso método molecular com outro método de diagnóstico (cultura, histologia). No entanto, atualmente não existe um padrão-ouro e o diagnóstico de infecções osteoarticulares geralmente se baseia em um acúmulo de argumentos. A regra do grupo de especialistas é determinar, com menor possibilidade de erro, se cada paciente incluído será "infectado". Esta metodologia é próxima da realidade clínica diária e confiada no médico que estava tratando o paciente. Se o estudo mostra uma vantagem da biologia molecular versus métodos clássicos em nossos grupos, então seria justificável discutir o diagrama de diagnóstico de infecções osteoarticulares.