Microbiología Molecular en la Infección por Artrosis (MOLOS)

Antecedentes: Las infecciones osteoarticulares son enfermedades dolorosas e incapacitantes que requieren un tratamiento antimicrobiano adaptado a los microorganismos implicados. Los cultivos microbiológicos se consideran actualmente como la referencia para la identificación de bacterias patógenas y parece que los cultivos microbiológicos son suficientes en la mayoría de los casos para establecer el diagnóstico. Sin embargo, la sensibilidad de estos cultivos es muy variable y depende tanto del contexto en el que se toman las muestras clínicas como del patógeno involucrado. Además, datos experimentales previos muestran que los métodos moleculares podrían producir un diagnóstico que no se encuentra en los cultivos convencionales. Objetivo principal: El objetivo del estudio es evaluar las prestaciones diagnósticas de los cultivos microbiológicos y el método molecular considerando para la definición de casos una acumulación de argumentos clínicos, radiológicos y biológicos habitualmente utilizados para establecer el diagnóstico de infecciones óseas y articulares. La discordancia de los dos métodos será clasificada secundariamente por un grupo de expertos en infección osteoarticular (compuesto por un bacteriólogo, un radiólogo, un cirujano, un anatomopatólogo y un reumatólogo). Hipótesis contrastada: Interés de los métodos moleculares para el diagnóstico de la osteoarticular Objetivo secundario: Cuantificación del retraso de los resultados obtenidos por los dos métodos Diseño del estudio: · Un centro especializado en infecciones osteoarticulares · Estudio prospectivo observacional · Dos métodos de diagnóstico: cultivos y métodos moleculares · Un grupo de expertos Incluyó pacientes y número de Pacientes: Total de 284 pacientes compuestos por 194 casos y 90 controles. Los pacientes incluidos (n=194) tendrán todos un diagnóstico de sospecha de infecciones osteoarticulares incluidas discitis, artritis séptica e infección de prótesis articular definida por los criterios de inclusión. Se compararán los resultados de los pacientes incluidos. a las obtenidas del grupo de pacientes control (n=90). Protocolo de duración: La duración del estudio es de 6 meses para cada paciente La duración del protocolo está prevista para 2 años Procedimientos: Todas las muestras serán tratadas con el mismo procedimiento - Muestras (líquidos sinoviales, biopsias,..) serán recuperadas ya sea durante la cirugía, por punción-aspiración a pie de cama, o por ultrasonografía guiada, todo ello en condiciones estériles (mascarilla, guantes estériles, cuidadosa preparación de la piel y toallas) y transportados al servicio de Bacteriología en tubos estériles sin sustrato adicional en menos de 12 horas. - Los procedimientos bacteriológicos se realizarán de acuerdo con las pautas aplicadas para la infección osteoarticular · Muestras líquidas: recuento de eritrocitos y leucocitos, porcentaje de polimorfonucleares · Muestras sólidas: trituradas con aparato mecánico · Tinción de Gram y auramina · Cultivos a 37°C en agar sangre de carnero Columbia (aeróbico y anaeróbico durante 5 días), agar chocolate suplementado con IsoVitaleX (con 5% de CO2 durante 5 días), caldo infusión cerebro corazón (anaeróbico durante 15 días con subcultivos realizados después de 10 días en el mismo medio de agar, incluso si el aspecto no era nublado).· Cultivo de micobacterias: medios Lowenstein-Jensen y COLETSOS, MGIT incubados durante 3 meses.- Procedimientos moleculares · Manipulaciones de ADN antes y después de PCR: en salas separadas con dispositivos de pipeteo separados para evitar la contaminación de las muestras con ADN extraño. · Equipo utilizado en los pasos previos a la PCR: libre de ADN y con radiación UV. · Extracción de ADN basada en el método de Boom: kit QIAGEN y EZ1 BioRobot · Amplificación del gen 16S rRNA de amplio rango · Amplicones: secuenciados en ambas direcciones en un analizador ABIPRISM 3100 (Applied Bio Systems, COURTABOEUF, Francia). · Experimentos de clonación de varias secuencias en una muestra · Análisis de secuencia: GenBank utilizando el programa BLASTN a través de la web del Centro Nacional de Información Biotecnológica.· PCR de control interno: gen de la b-actina· PCR en tiempo real: para la detección de micobacterias y artritis gonocócica- Implicaciones potenciales: Podríamos haber optado, como la mayoría de los estudios publicados hasta la fecha, por comparar nuestro método molecular con otro método de diagnóstico (cultivo, histología). Sin embargo, actualmente no existe un estándar de oro y el diagnóstico de infecciones osteoarticulares generalmente se basa en una acumulación de argumentos. La regla del grupo de expertos es determinar, con el menor error posible, si cada paciente incluido estará “infectado”. Esta metodología es cercana a la realidad clínica diaria y de confianza en el médico que trataba al paciente. Si el estudio muestra una ventaja de la biología molecular frente a los métodos clásicos en nuestros grupos, entonces estaría justificado discutir el diagrama de diagnóstico de las infecciones osteoarticulares.