Bronchoalveolární laváž laterální průtokový přístroj pro invazivní plicní aspergilózu: multicentrická studie

Výhled projektu Ke zlepšení přežití jsou naléhavě potřeba citlivé a specifické biomarkery pro včasnou diagnostiku IPA. V této multicentrické studii vyhodnotíme potenciál nového laterálního průtokového zařízení pro časnou diagnostiku IPA u lůžka.

Úspěšná realizace hypotézy studií vyžaduje solidní zázemí v oblasti IPA. Vzhledem k tomu jsem přesvědčen, že moje profesionální zkušenosti v kombinaci s technickou a vědeckou odborností v mém hostitelském ústavu a přidružených laboratořích vytvářejí vysoce konkurenční a slibné prostředí. Úspěch navrhovaného výzkumu bude životně záviset na spolupráci. V posledních čtyřech letech jsem intenzivně pracoval v oblasti IPA mezi pacienty s hematoonkologickými malignitami, což mi umožnilo navázat potřebné kontakty a spolupráci, které jsou pro úspěch projektu zásadní. Hlavní předností této multicentrické studie je proto spolupráce se třemi hlavními centry pro diagnostiku IPA pod vedením tří vynikajících odborníků (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt a Prof. Willinger), kteří v posledních letech/desetiletích rozsáhle publikovali v oblasti diagnostiky IPA. Jsem si jist, že naše výsledky budou mít dalekosáhlou implementaci pro celou oblast IPA. Je zřejmé, že významně posouvají naše chápání klinického výkonu nových aplikací v místě péče.

Očekává se, že projekt bude mít velký dopad na péči o pacienty. Zavedení testu Lateral Flow Device může vést k rychlým, upřímně řečeno na lůžku, dostupným výsledkům testů, a může tak umožnit dřívější zahájení vhodné antimykotické terapie, která může pomoci zachránit životy.

1. Pozadí

   Invazivní mykotické infekce (IFI) jsou důležitou příčinou morbidity a mortality u pacientů s hematoonkologickými malignitami [1-3]. Invazivní plísňové infekce (IMI), zejména invazivní aspergilóza (IA), jsou hlavní příčinou IFI mezi těmito pacienty, následované invazivními kandidovými infekcemi (2, 4). Vzhledem k hrubé mortalitě 80–90 % při absenci adekvátní léčby jsou klíčovými faktory úspěšné léčby IFI včasná diagnostika a včasné zahájení antimykotické léčby. Různé studie ukázaly, že včasné zahájení antimykotické léčby může zlepšit přežití IFI nad 80 % (5, 6). Klinické příznaky a symptomy IFI i radiologické nálezy jsou však často nespecifické. Neschopnost důsledně stanovit včasnou a přesvědčivou diagnózu proto zůstává jedním z hlavních problémů. Kooperativní skupina Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakovinových invazivních plísňových infekcí (EORTC) a Studijní skupina mykóz Národního institutu pro alergie a infekční choroby (MSG) měly určitý úspěch při řešení tohoto problému stanovením konsensuálních definic pro oportunní IFI (7 ). Definice v pokynech EORTC/MSG však vycházely nejen z rešerše literatury, ale také z názorů odborníků a následného mezinárodního konsenzu. Hlavním důvodem bylo, že studie hodnotící detaily definic nebyly zčásti jednoduše dostupné. V nedávné kohortní studii naše pracovní skupina navrhla některé úpravy kritérií (8).

   Při použití kritérií EORTC/MSG prevalence IFI silně závisí na mykologických důkazech, které není snadné získat. Kultivační diagnostické přístupy nevyžadují pouze invazivní diagnostické postupy, kterým často brání závažný zdravotní stav u pacientů s rizikem IFI, ale také ve skutečnosti často vedou k falešně negativním výsledkům. Testování antigenu s rychle dostupnými výsledky testů je proto stále důležitější pro vytvoření realistického obrazu zátěže IFI a umožnění včasné diagnózy a léčby u pacientů s IFI (1). Testování antigenu může nejen usnadnit včasnou diagnózu, ale může také zabránit nadměrnému léčení, které se stalo častým. Nedávná studie Azoulaye a kolegů, kteří hodnotili antimykotickou terapii v jeden den v několika francouzských nemocnicích, potvrdila, že ve skutečnosti většina pacientů, kteří dostávali antimykotika, ve skutečnosti IFI neměla (9). Nadměrná léčba může nejen výrazně zvýšit náklady (denní náklady na většinu antimykotik 600-1000 EUR), ale může také vést k rozvoji rezistence (10). Použití vysoce citlivých a specifických rychle dostupných antigenních testů/biomarkerů může klinického lékaře vést k zahájení antimykotické léčby pouze u pacientů, kteří mají prospěch z léčby, protože skutečně mají IFI. V neposlední řadě může být vyšetření antigenu také užitečné pro hodnocení časné odpovědi, monitorování terapie a stratifikaci léčby včetně rozhodnutí, kdy u pacientů s IA antimykotikum ukončit (11–12).

   Jedním z hlavních omezení testu GM je to, že doba k dosažení výsledků se mezi centry liší (mezi méně než jedním dnem a až několika dny), zejména v závislosti na počtu vzorků testovaných v rutině (protože test se provádí s destičkami pokrývajícími 96 testy) a vzdálenost/dobu přepravy mezi klinickým prostředím a laboratoří, kde se test provádí. Tato omezení překonává Lateral Flow Device Test, bod péče pro IA vyvinutý prof. Thorntonem z University of Exeter, Spojené království. Tento test s jedním vzorkem lze snadno provést v každé laboratoři pomocí BAL a vzorků séra a doba k dosažení výsledku je přibližně 20 minut. Nedávné studie ukázaly obrovský potenciál testu ve vzorcích lidské BAL a séra (13-15). Ve velmi nedávné studii naše pracovní skupina retrospektivně vyhodnotila test LFD pomocí vzorků bronchoalveolární laváže (BAL) od pacientů s hematologickými malignitami a pacientů po transplantaci solidních orgánů (SOT). Bylo zahrnuto 39 vzorků BAL od 37 pacientů (29 vzorků hematologických malignit a 10 vzorků SOT; 12 pravděpodobná IPA, 9 možných IPA, 16 žádná IPA). Senzitivita a specificita testu BAL LFD pro pravděpodobnou IPA byla 100 % a 81 %. Hladiny GM v případech s negativní LFD byly významně nižší než u pacientů s pozitivní LFD (P <0,0001). Došli jsme k závěru, že LFD test vzorků BAL se provádí snadno a poskytuje přesné a rychle dostupné výsledky. Tento nový bod péče tedy může být velmi slibným diagnostickým přístupem pro detekci IPA ve vzorcích BAL od pacientů s hematologickou malignitou a SOT (16). Další nedávná studie prokázala na modelu neutropenických morčat, že test LFD je reprodukovatelný mezi různými laboratořemi a studiemi (17). K dalšímu vyhodnocení testu jsou však zapotřebí multicentrické studie (16).

   V navrhované studii vyhodnotíme BAL Lateral Flow Device Test a porovnáme výsledky s rutinně prováděnými hodnotami galaktomannanu a také s výsledky kultivace a PCR.

2. Návrh a metody studie 2.1. Návrh studie Návrh studie je průzkumný, retrospektivní a multicentrický. Studium bude zahájeno v březnu 2013 v délce 13 měsíců.

   2.2. Studijní místa

   1. Sekce infekčních nemocí, Klinika vnitřního lékařství Lékařské univerzity v Grazu, Rakousko
   2. Divize hygieny a lékařské mikrobiologie, Innsbruck Medical University, Rakousko
   3. Divize klinické mikrobiologie, Lékařská univerzita ve Vídni, Rakousko
   4. Univerzitní nemocnice v Mannheimu, Univerzita v Heidelbergu, Německo

   2.3. Studijní populace Všechny skladované nebo rutinně získané vzorky BAL od dospělých pacientů s rizikem invazivní plicní aspergilózy budou způsobilé pro zařazení do studie. Ošetřující lékaři budou zaslepeni vůči výsledkům testu BAL Lateral Flow Device, a test proto nebude mít žádný vliv na rozhodnutí o správě pacienta / léčbě. Ošetřující lékaři budou zaslepeni k výsledkům testu BAL Lateral Flow Device. Výsledky testů proto nebudou mít žádný vliv na klinická/léčebná rozhodnutí, a tudíž neovlivní zahrnuté pacienty.

   Základní onemocnění, stav EORTC IFI (oba dostupné z klinické objednávky doprovázející vzorek BAL) a další výsledky mikrobiologických/mykologických testů budou zaznamenány v elektronické databázi. Nebudou vyžadovány žádné osobní údaje týkající se pacienta.

   2.3.1 Klíčová kritéria pro zařazení

   1. Pacienti starší 18 let.
   2. Vzorek BAL získaný v klinické praxi.

   3. Hrozí IFI (podle ošetřujících lékařů). Rizikové faktory mohou zahrnovat:

      • febrilní neutropenie
      • indukční chemoterapie
      • alogenní transplantace kmenových buněk/štěp proti hostiteli
      • klinické/radiologické/mykologické nálezy podezřelé z IFI
      • Transplantace pevných orgánů
      • pacient JIP
      • Cirhóza jater 2.3.2 Klíčová kritéria vyloučení
   1. Ve věku do 18 let.
   2. V klinické praxi nebyl získán žádný vzorek BAL.

   d.) Není ohroženo pro IFI.

   2.4. Testování pomocí zařízení pro laterální průtok Výše ​​popsané zařízení pro laterální průtok je hodnoceno v BAL od pacientů s rizikem invazivní aspergilózy. Stručně řečeno, monoklonální protilátka imunoglobulinu G (IgG) (JF5) k epitopu na extracelulárním antigenu sekretovaném konstitutivně během aktivního růstu Aspergillus je imobilizována v záchytné zóně na porézní nitrocelulózové membráně. JF5 IgG je také konjugován s částicemi koloidního zlata, které slouží jako detekční činidlo. Tekutina BAL (100 μl čistého vzorku, bez předchozí úpravy) se přidá na uvolňovací podložku obsahující konjugát protilátka-zlato, který váže cílový antigen, a poté prochází porézní membránou a váže se na monoklonální protilátku JF5 IgG imobilizovanou v záchytná zóna. Lateral Flow Device (LFD) Výsledky budou odečteny 15 minut po vložení vzorku. Navázané komplexy antigen-protilátka-zlato jsou pozorovány jako červená čára (T pro test) s intenzitou úměrnou koncentraci antigenu a byly klasifikovány jako negativní, slabě pozitivní, středně pozitivní nebo silně pozitivní (obr. 1). Anti-myší imunoglobulin imobilizovaný na membráně v oddělené zóně (C pro kontrolu) slouží jako vnitřní kontrola (13, 15). Podrobné informace o produktu lze nalézt v přiložené publikaci „Vývoj imunochromatografického laterálního průtokového zařízení pro rychlou sérodiagnozu invazivní aspergilózy“ (14).

   Vzhledem k tomu, že zařízení prochází procesem označení CE pro evropské použití jako lékařský diagnostický prostředek, lze aktuální výsledky sledovat pouze jako multicentrické srovnání prototypů (bez klinických důsledků pro léčbu pacientů).

3. Statistická hlediska Statistická analýza včetně vícerozměrných analýz bude provedena ve spolupráci s mj. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas z Institutu lékařské informatiky, statistiky a dokumentace Lékařské univerzity v Grazu a Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Univerzita v Salcburku.

3.1. Výpočet velikosti vzorku Vzhledem k návrhu průzkumné studie není možný statistický výpočet velikosti vzorku. Velikost vzorků byla vypočítána pomocí nedávno publikovaných epidemiologických dat ze zúčastněných center (3, 16). Navrhovaný počet pacientů, kteří mají být vyšetřeni, je reprezentativní a vhodný pro získání údajů pro další studie a statistický poradce jej považoval za dostatečný.

3.2. Statistická analýza Statistická analýza bude provedena pomocí SPSS ve spolupráci s našimi specializovanými spolupracovníky uvedenými výše.

Reference

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Podceňování skutečné zátěže invazivními plísňovými infekcemi u příjemců transplantací hematopoetických kmenových buněk? Clin Infect Dis. 15. července 2010;51(2):253,4; odpověď autora 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ a kol. Prospektivní surveillance invazivních mykotických infekcí u příjemců transplantovaných hematopoetických kmenových buněk, 2001-2006: Přehled databáze sítě pro sledování infekcí spojených s transplantací (TRANSNET). Clin Infect Dis. 15. dubna 2010;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et al. Vliv testování galaktomannanu na prevalenci invazivní aspergilózy u pacientů s hematologickými malignitami. Med Mycol. 2012 duben;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M a kol. Celostátní rakouský registr aspergilů: Prospektivní sběr dat o epidemiologii, terapii a výsledcích invazivních plísňových infekcí u imunokompromitovaných a/nebo imunosuprimovaných pacientů. Int J Antimicrob Agents. Prosinec 2010;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O a kol. Zobrazovací nálezy u akutní invazivní plicní aspergilózy: Klinický význam znaku halo. Clin Infect Dis. 1. února 2007;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. Význam perkutánní plicní biopsie řízené počítačovou tomografií pro diagnostiku invazivní mykotické infekce u imunokompromitovaných pacientů. Clin Infect Dis. 1. října 2007;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T a kol. Revidované definice invazivních plísňových onemocnění od evropské organizace pro výzkum a léčbu kooperativní skupiny Cancer/Invasive mykotické infekce a konsenzuální skupiny Národního institutu pro alergie a infekční onemocnění mykózy (EORTC/MSG). Clin Infect Dis. 15. června 2008;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et al. Evropská organizace pro výzkum a léčbu hostitelských faktorů Cancer/Mycoses study group (EORTC/MSG) a invazivních mykotických infekcí u pacientů s hematologickými malignitami. J Antimicrob Chemother. 7. května 2012
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A a kol. Systémová antimykotická léčba u kriticky nemocných pacientů bez invazivní mykotické infekce*. Crit Care Med. březen 2012;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ a kol. Klinické důsledky azolové rezistence u Aspergillus fumigatus, Nizozemsko, 2007-2009. Emerg Infect Dis. říjen 2011;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Užitečnost testu sérového galaktomannanu pro hodnocení časné odpovědi a léčebné stratifikace invazivní aspergilózy. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29. června 2012; DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ a kol. Invazivní plísňové infekce u pacientů s hematologickými malignitami v terciárním onkologickém centru: pitevní studie po dobu 15 let (1989-2003). Hematologická. červenec 2006;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Detekce invazivní plicní aspergilózy u pacientů s hematologickými malignitami pomocí technologie laterálního průtoku. J Vis Exp. 22. března 2012;(61). pii: 3721. doi(61):10,3791/3721.
14. Thornton ČR. Vývoj imunochromatografického laterálního průtokového zařízení pro rychlou sérodiagnostickou diagnostiku invazivní aspergilózy. Clin Vaccine Immunol. 2008 Jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton ČR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Srovnání technologie laterálního průtoku a stanovení galaktomannanu a (1->3)-beta-D-glukanu pro detekci invazivní plicní aspergilózy. Clin Vaccine Immunol. Prosinec 2009;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Bronchoalveolární laváž laterální průtokový přístroj pro diagnostiku invazivní plicní aspergilózy u hematologických malignit a pacientů po transplantaci solidních orgánů. J Infect. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton ČR. Mezilaboratorní a mezistudijní reprodukovatelnost nového zařízení s laterálním průtokem a vliv antimykotické terapie na detekci invazivní plicní aspergilózy. J Clin Microbiol. 2013; epup před tiskem