Test urządzenia do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego z przepływem bocznym w kierunku inwazyjnej aspergilozy płucnej: badanie wieloośrodkowe

Perspektywy projektu Pilnie potrzebne są czułe i specyficzne biomarkery do wczesnej diagnozy IPA, aby poprawić przeżywalność. W tym wieloośrodkowym badaniu ocenimy potencjał nowatorskiego testu urządzenia bocznego przepływu we wczesnej, przyłóżkowej diagnostyce IPA.

Skuteczna realizacja hipotezy badawczej wymaga solidnego przygotowania w zakresie IPA. Biorąc to pod uwagę, jestem przekonany, że moje doświadczenie zawodowe w połączeniu z wiedzą techniczną i naukową w moim instytucie goszczącym i powiązanych laboratoriach tworzy wysoce konkurencyjne i obiecujące otoczenie. Sukces proponowanych badań będzie w dużej mierze zależał od współpracy. W ciągu ostatnich czterech lat intensywnie pracowałem w obszarze IPA wśród pacjentów z nowotworami hemato-onkologicznymi, co pozwoliło mi na nawiązanie niezbędnych kontaktów i współpracy, które są kluczowe dla powodzenia projektu. Siłą tego wieloośrodkowego badania jest zatem współpraca z trzema głównymi ośrodkami diagnostyki IPA pod przewodnictwem trzech wybitnych ekspertów (prof. Lass-Flörl, prof. Buchheidt i prof. Willinger), którzy w ostatnich latach/dekadach publikowali obszernie w dziedzinie diagnostyki IPA. Jestem przekonany, że nasze wyniki będą miały dalekosiężne zastosowania w całym obszarze IPA. Oczywiście znacznie poszerzą naszą wiedzę na temat skuteczności klinicznej nowatorskich zastosowań w punktach opieki.

Oczekuje się, że projekt będzie miał duży wpływ na opiekę nad pacjentem. Ustanowienie testu urządzenia do bocznego przepływu może doprowadzić do szybkiego, szczerze mówiąc przy łóżku pacjenta, dostępnych wyników badań, a tym samym może umożliwić wcześniejsze rozpoczęcie odpowiedniej terapii przeciwgrzybiczej, która może pomóc uratować życie.

1. Tło

   Inwazyjne zakażenia grzybicze (IFI) są ważną przyczyną zachorowalności i śmiertelności wśród pacjentów z nowotworami układu krwiotwórczego (1-3). Inwazyjne infekcje pleśniowe (IMI), w szczególności inwazyjna aspergiloza (IA), są główną przyczyną IFI wśród tych pacjentów, a następnie inwazyjne infekcje Candida (2, 4). Ze względu na surową śmiertelność wynoszącą 80-90% w przypadku braku odpowiedniego leczenia, wczesna diagnoza i wczesne rozpoczęcie leczenia przeciwgrzybiczego są kluczowymi czynnikami skutecznego leczenia IFI. Różne badania wykazały, że wczesne rozpoczęcie leczenia przeciwgrzybiczego może poprawić przeżywalność IFI do ponad 80% (5, 6). Kliniczne objawy przedmiotowe i podmiotowe IFI oraz wyniki badań radiologicznych są jednak często niespecyficzne. Niezdolność do konsekwentnego postawienia wczesnej i przekonującej diagnozy pozostaje zatem jednym z głównych problemów. European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) oraz Mycoses Study Group of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (MSG) odniosły pewien sukces w rozwiązaniu tego problemu, ustalając konsensusowe definicje oportunistycznego IFI (7). ). Jednak definicje w wytycznych EORTC/MSG opierały się nie tylko na przeglądzie literatury, ale także na opiniach ekspertów i późniejszym międzynarodowym konsensusie. Głównym powodem był fakt, że badania oceniające szczegóły definicji były częściowo po prostu niedostępne. W niedawnym badaniu kohortowym nasza grupa robocza zaproponowała pewne modyfikacje kryteriów (8).

   Przy stosowaniu kryteriów EORTC/MSG częstość występowania IFI silnie zależy od dowodów mikologicznych, które nie są łatwe do uzyskania. Podejścia diagnostyczne oparte na hodowli nie tylko wymagają inwazyjnych procedur diagnostycznych, które często są utrudnione przez ciężki stan zdrowia pacjentów zagrożonych IFI, ale w rzeczywistości często dają fałszywie negatywne wyniki. Testy antygenowe z szybko dostępnymi wynikami stają się zatem coraz ważniejsze, aby uzyskać realistyczny obraz obciążenia IFI i umożliwić wczesną diagnozę i leczenie pacjentów z IFI (1). Testy antygenowe mogą nie tylko ułatwić wczesną diagnozę, ale mogą również zapobiec nadmiernemu leczeniu, które stało się częste. Niedawne badanie przeprowadzone przez Azoulaya i współpracowników, którzy oceniali terapię przeciwgrzybiczą jednego dnia w wielu francuskich szpitalach, potwierdziło, że w rzeczywistości większość pacjentów otrzymujących leki przeciwgrzybicze w rzeczywistości nie miała IFI (9). Nadmierne leczenie może nie tylko znacznie zwiększyć koszty (dzienne koszty większości leków przeciwgrzybiczych 600-1000 €), ale może również doprowadzić do rozwoju oporności (10). Zastosowanie wysoce czułych i swoistych, szybko dostępnych testów antygenowych/biomarkerów może skłonić klinicystę do rozpoczęcia leczenia przeciwgrzybiczego tylko u pacjentów, którzy odniosą korzyści z leczenia, ponieważ rzeczywiście mają IFI. Wreszcie, testowanie antygenów może być również przydatne do oceny wczesnej odpowiedzi, monitorowania terapii i stratyfikacji leczenia, w tym decyzji, kiedy przerwać terapię przeciwgrzybiczą u pacjentów z IA (11-12).

   Jednym z głównych ograniczeń testu GM jest różny czas uzyskiwania wyników w poszczególnych ośrodkach (od mniej niż jednego dnia do kilku dni), głównie w zależności od liczby rutynowo badanych próbek (ponieważ test przeprowadza się na płytkach pokrywających 96 badań) oraz odległość/czas transportu między placówką kliniczną a laboratorium, w którym przeprowadza się badanie. Ograniczenia te zostały przezwyciężone przez test urządzenia z przepływem bocznym, test w miejscu opieki dla IA opracowany przez prof. Thorntona z University of Exeter w Wielkiej Brytanii. Ten test pojedynczej próbki można łatwo wykonać w każdym laboratorium przy użyciu próbek BAL i surowicy, a czas oczekiwania na wynik wynosi około 20 minut. Ostatnie badania wykazały ogromny potencjał testu w ludzkich próbkach BAL i surowicy (13-15). W niedawno przeprowadzonym badaniu nasza grupa robocza dokonała retrospektywnej oceny testu LFD przy użyciu próbek popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) od pacjentów z nowotworami hematologicznymi i pacjentów po przeszczepieniu narządów miąższowych (SOT). Uwzględniono trzydzieści dziewięć próbek BAL od 37 pacjentów (29 próbek nowotworów hematologicznych i 10 próbek SOT; 12 prawdopodobnych IPA, 9 możliwych IPA, 16 bez IPA). Czułość i swoistość testu BAL LFD dla prawdopodobnego IPA wyniosły odpowiednio 100% i 81%. Poziomy GM w przypadkach z ujemnym LFD były istotnie niższe niż u pacjentów z dodatnim LFD (P <0,0001). Doszliśmy do wniosku, że test LFD próbek BAL jest łatwy do wykonania i zapewnia dokładne i szybko dostępne wyniki. Dlatego ten nowy test przyłóżkowy może być bardzo obiecującym podejściem diagnostycznym do wykrywania IPA w próbkach BAL od pacjentów z nowotworami hematologicznymi i SOT (16). W innym niedawnym badaniu na modelu świnki morskiej z neutropenią wykazano, że test LFD jest powtarzalny w różnych laboratoriach i badaniach (17). Do dalszej oceny testu potrzebne są jednak badania wieloośrodkowe (16).

   W proponowanym badaniu ocenimy test urządzenia bocznego przepływu BAL i porównamy wyniki z rutynowo wykonywanymi wartościami galaktomannanu, a także wynikami hodowli i PCR.

2. Projekt badania i metody 2.1. Projekt badania Projekt badania jest eksploracyjny, retrospektywny i wieloośrodkowy. Badanie rozpocznie się w marcu 2013 i potrwa 13 miesięcy.

   2.2. Miejsca do nauki

   1. Sekcja Chorób Zakaźnych, Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Grazu, Austria
   2. Zakład Higieny i Mikrobiologii Medycznej, Uniwersytet Medyczny w Innsbrucku, Austria
   3. Oddział Mikrobiologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Wiedniu, Austria
   4. Szpital Uniwersytecki w Mannheim, Uniwersytet w Heidelbergu, Niemcy

   2.3. Populacja badana Wszystkie przechowywane lub rutynowo pobierane próbki BAL od dorosłych pacjentów zagrożonych inwazyjną aspergilozą płuc kwalifikują się do włączenia do badania. Lekarze prowadzący leczenie nie będą znali wyników testu urządzenia do bocznego przepływu BAL, a zatem test nie będzie miał wpływu na postępowanie z pacjentem/decyzje dotyczące leczenia. Lekarze leczący nie będą znali wyników testu Urządzenia Bocznego Przepływu BAL. Wyniki badań nie będą zatem miały wpływu na decyzje kliniczne / dotyczące leczenia, a zatem nie będą miały wpływu na włączonych pacjentów.

   Choroby podstawowe, status EORTC IFI (oba dostępne w zleceniu klinicznym dołączonym do próbki BAL) oraz inne wyniki badań mikrobiologicznych/mikologicznych zostaną zapisane w elektronicznej bazie danych. Żadne dane osobowe dotyczące pacjenta nie będą wymagane.

   2.3.1 Kluczowe kryteria włączenia

   1. Pacjenci powyżej 18 roku życia.
   2. Próbka BAL uzyskana w rutynowych badaniach klinicznych.

   3. Zagrożone IFI (według lekarzy prowadzących). Czynniki ryzyka mogą obejmować:

      • gorączka neutropeniczna
      • chemioterapia indukcyjna
      • allogeniczny przeszczep komórek macierzystych/choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi
      • wyniki kliniczne/radiologiczne/mykologiczne podejrzane o IFI
      • Przeszczep narządów litych
      • Pacjent OIOM
      • Marskość wątroby 2.3.2 Kluczowe kryteria wykluczenia
   1. Poniżej 18 roku życia.
   2. Nie uzyskano próbki BAL w rutynowych badaniach klinicznych.

   d.) Brak ryzyka dla IFI.

   2.4. Testowanie urządzenia z przepływem bocznym Opisane wcześniej urządzenie z przepływem bocznym jest oceniane w BAL od pacjentów z ryzykiem inwazyjnej aspergilozy. Pokrótce, przeciwciało monoklonalne immunoglobuliny G (IgG) (JF5) przeciwko epitopowi na zewnątrzkomórkowym antygenie wydzielanym konstytutywnie podczas aktywnego wzrostu Aspergillus jest immobilizowane w strefie wychwytywania na porowatej membranie nitrocelulozowej. JF5 IgG jest również skoniugowany z cząsteczkami złota koloidalnego, aby służyć jako odczynnik wykrywający. Płyn BAL (100 μl czystej próbki, bez wstępnego przygotowania) dodaje się do podkładki antyadhezyjnej zawierającej koniugat przeciwciało-złoto, który wiąże docelowy antygen, a następnie przechodzi przez porowatą membranę i wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym JF5 IgG unieruchomionym w strefa przechwytywania. Wyniki urządzenia do pomiaru przepływu bocznego (LFD) zostaną odczytane 15 minut po załadowaniu próbki. Związane kompleksy antygen-przeciwciało-złoto są obserwowane jako czerwona linia (T dla testu) o intensywności proporcjonalnej do stężenia antygenu i zostały sklasyfikowane jako ujemne, słabo dodatnie, umiarkowanie dodatnie lub silnie dodatnie (ryc. 1). Anty-mysia immunoglobulina unieruchomiona na błonie w oddzielnej strefie (C dla kontroli) służy jako kontrola wewnętrzna (13, 15). Szczegółowe informacje o produkcie można znaleźć w załączonej publikacji „Development of an Immunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillosis” (14).

   Ponieważ urządzenie jest w trakcie uzyskiwania oznakowania CE do użytku w Europie jako medyczne urządzenie diagnostyczne, bieżące wyniki można przeglądać jedynie jako wieloośrodkowe porównanie testów prototypu (bez implikacji klinicznych dla postępowania z pacjentem).

3. Kwestie statystyczne Analiza statystyczna, w tym analizy wielowymiarowe, zostanie przeprowadzona we współpracy z ao. Uniw. prof. mgr inż. dr technik. Josef Haas z Instytutu Informatyki Medycznej, Statystyki i Dokumentacji Uniwersytetu Medycznego w Grazu i Univ. Doz. Mag. Dr Herbert Schwetz, Uniwersytet w Salzburgu.

3.1. Obliczenie liczebności próby Ze względu na projekt badania eksploracyjnego nie jest możliwe statystyczne obliczenie liczebności próby. Wielkość próby została obliczona na podstawie ostatnio opublikowanych danych epidemiologicznych z zaangażowanych ośrodków (3, 16). Proponowana liczba pacjentów do zbadania jest reprezentatywna i odpowiednia do generowania danych do dalszych badań i została uznana za odpowiednią przez doradcę statystycznego.

3.2. Analiza statystyczna Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu SPSS we współpracy z naszymi wyspecjalizowanymi współpracownikami, o których mowa powyżej.

Bibliografia

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Niedocenianie rzeczywistego obciążenia inwazyjnymi infekcjami grzybiczymi u biorców krwiotwórczych komórek macierzystych? Clin Infect Dis. 2010 15 lipca;51(2):253,4; odpowiedź autora 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ i in. Perspektywiczny nadzór nad inwazyjnymi zakażeniami grzybiczymi u biorców przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych, 2001-2006: Przegląd bazy danych sieci nadzoru zakażeń związanych z przeszczepami (TRANSNET). Clin Infect Dis. 2010 15 kwietnia;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A i in. Wpływ badań galaktomannanowych na częstość występowania inwazyjnej aspergilozy u pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Med Mykol. 2012 kwiecień;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. Ogólnokrajowy austriacki rejestr aspergillus: prospektywne gromadzenie danych na temat epidemiologii, terapii i wyników inwazyjnych infekcji pleśniowych u pacjentów z obniżoną odpornością i/lub z obniżoną odpornością. Int J Środki przeciwdrobnoustrojowe. Grudzień 2010;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O i in. Wyniki badań obrazowych w ostrej inwazyjnej aspergilozie płucnej: znaczenie kliniczne znaku halo. Clin Infect Dis. 1 lutego 2007;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. Wartość przezskórnej biopsji płuc pod kontrolą tomografii komputerowej w diagnostyce inwazyjnego zakażenia grzybiczego u pacjentów z obniżoną odpornością. Clin Infect Dis. 1 października 2007;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T i in. Zmienione definicje inwazyjnej choroby grzybiczej opracowane przez Europejską Organizację ds. Badań i Leczenia Nowotworów/Inwazyjnych Zakażeń Grzybiczych oraz grupę konsensusową Krajowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (EORTC/MSG). Clin Infect Dis. 15 czerwca 2008;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A i in. Europejska organizacja zajmująca się badaniami i leczeniem czynników gospodarza grupy badawczej Cancer/Mycoses (EORTC/MSG) oraz inwazyjnych zakażeń grzybiczych u pacjentów z nowotworami hematologicznymi. J Antybakteryjna chemioterapia. 7 maja 2012 r.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et al. Ogólnoustrojowa terapia przeciwgrzybicza u pacjentów w stanie krytycznym bez inwazyjnego zakażenia grzybiczego*. Krytyczna opieka med. 2012 marzec;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Implikacje kliniczne oporności na azole u Aspergillus fumigatus, Holandia, 2007-2009. Emergowa choroba zakaźna. Paź 2011;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Przydatność testu galaktomannanu w surowicy do oceny wczesnej odpowiedzi i stratyfikacji leczenia inwazyjnej aspergilozy. Reprezentant infekcji grzybiczej Curr [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29 czerwca 2012; DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ i in. Inwazyjne zakażenia grzybicze u pacjentów z nowotworami hematologicznymi w ośrodku onkologicznym trzeciego stopnia opieki: badanie autopsyjne w okresie 15 lat (1989-2003). Hematologia. Lipiec 2006;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami hematologicznymi za pomocą technologii przepływu bocznego. J Vis Exp. 2012-03-22;(61). pii: 3721. doi(61):10,3791/3721.
14. Thornton CR. Opracowanie immunochromatograficznego urządzenia bocznego przepływu do szybkiej serodiagnostyki inwazyjnej aspergilozy. Szczepionka Clin Immunol. Lipiec 2008;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Porównanie technologii bocznego przepływu i testów galaktomannanu i (1->3)-beta-D-glukanu do wykrywania inwazyjnej aspergilozy płucnej. Szczepionka Clin Immunol. Grudzień 2009;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W i in. Test urządzenia do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego z bocznym przepływem w diagnostyce inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z nowotworami hematologicznymi i przeszczepami narządów miąższowych. J zarażać. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Odtwarzalność międzylaboratoryjna i między badaniami nowego urządzenia z przepływem bocznym oraz wpływ terapii przeciwgrzybiczej na wykrywanie inwazyjnej aspergilozy płucnej. Mikrobiol J Clin. 2013; eup przed drukiem