Bronkoalveolaarinen pesu lateraalivirtauslaitetesti invasiiviseen keuhkoaspergilloosiin: monikeskustutkimus

Projektin näkymät Herkkiä ja erityisiä biomarkkereita IPA:n varhaiseen diagnosointiin tarvitaan kiireellisesti selviytymisen parantamiseksi. Tässä monikeskustutkimuksessa arvioimme uuden Lateral Flow Device -testin potentiaalia IPA:n varhaisessa vuodediagnoosissa.

Tutkimushypoteesin onnistunut toteuttaminen edellyttää vankkaa taustaa IPA-alalta. Tämän huomioon ottaen olen varma, että ammatillinen kokemukseni yhdistettynä isäntälaitokseni ja siihen liittyvien laboratorioiden tekniseen ja tieteelliseen asiantuntemukseen luo erittäin kilpailukykyisen ja lupaavan ympäristön. Ehdotetun tutkimuksen onnistuminen riippuu olennaisesti yhteistyöstä. Viimeisen neljän vuoden aikana olen työskennellyt laajasti IPA-alalla hematoonkologisia pahanlaatuisia kasvaimia sairastavien potilaiden parissa, minkä ansiosta olen saanut hankkeen onnistumisen kannalta välttämättömät kontaktit ja yhteistyöt. Tämän monikeskustutkimuksen suurin vahvuus on siksi yhteistyö kolmen suuren IPA-diagnoosikeskuksen kanssa kolmen erinomaisen asiantuntijan johdolla (Prof. Lass-Flörl, prof. Buchheidt ja prof. Willinger), jotka ovat julkaisseet laajasti IPA-diagnoosin alalla viime vuosina/vuosikymmeninä. Olen varma, että tuloksillamme on kauaskantoisia toteutuksia koko IPA-alalle. On selvää, että ne lisäävät merkittävästi ymmärrystämme uusien hoitopistesovellusten kliinisestä suorituskyvystä.

Hankkeella odotetaan olevan suuri vaikutus potilaiden hoitoon. Lateral Flow Device -testin perustaminen voi johtaa nopeasti, suoraan vuodepaikalla, saatavilla oleviin testituloksiin ja voi siten mahdollistaa asianmukaisen sienilääkityksen aikaisemman aloittamisen, mikä voi auttaa pelastamaan ihmishenkiä.

1. Tausta

   Invasiiviset sieni-infektiot (IFI) ovat tärkeä sairastuvuuden ja kuolleisuuden aiheuttaja potilailla, joilla on hematoonkologisia pahanlaatuisia kasvaimia (1-3). Invasiiviset homeinfektiot (IMI), erityisesti invasiivinen aspergilloosi (IA) ovat suurin IFI:n aiheuttaja näillä potilailla, ja niitä seuraavat invasiiviset Candida-infektiot (2, 4). Koska 80–90 %:n karkea kuolleisuus on riittävän hoidon puuttuessa, oikea-aikainen diagnoosi ja sienilääkityksen varhainen aloittaminen ovat keskeisiä tekijöitä IFI:n onnistuneessa hoidossa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että antifungaalisen hoidon varhainen aloittaminen voi parantaa IFI-eloonjäämistä yli 80 %:iin (5, 6). IFI:n kliiniset merkit ja oireet sekä radiologiset löydökset ovat kuitenkin usein epäspesifisiä. Yksi keskeinen ongelma on siksi kyvyttömyys tehdä johdonmukaisesti varhaista ja vakuuttavaa diagnoosia. European Organisation for Cancer Invasiivisten sieni-infektioiden yhteistyöryhmä (EORTC) ja kansallisen allergia- ja tartuntatautiinstituutin (MSG) mycoses-tutkimusryhmä onnistuivat jonkin verran tämän ongelman ratkaisemisessa laatimalla konsensusmääritelmät opportunistiselle IFI:lle (7). ). EORTC/MSG-ohjeiden määritelmät eivät kuitenkaan perustuneet pelkästään kirjallisuuden katsaukseen, vaan myös asiantuntijalausuntoon ja sitä seuranneeseen kansainväliseen konsensukseen. Pääsyynä oli se, että määritelmien yksityiskohtia arvioivia tutkimuksia ei ollut osittain saatavilla. Äskettäisessä kohorttitutkimuksessa työryhmämme ehdotti joitain muutoksia kriteereihin (8).

   EORTC/MSG-kriteereitä käytettäessä IFI:n esiintyvyys riippuu voimakkaasti mykologisista todisteista, joita ei ole helppo saada. Viljelyyn perustuvat diagnostiset lähestymistavat eivät vaadi ainoastaan ​​invasiivisia diagnostisia toimenpiteitä, joita usein haittaa IFI-riskissä olevien potilaiden vakava sairaus, vaan ne myös usein johtavat virheellisesti negatiivisiin tuloksiin. Antigeenitestauksesta nopeasti saatavilla olevilla testituloksilla on siksi tullut yhä tärkeämpää, jotta saadaan realistinen kuva IFI-taakasta ja mahdollistetaan varhainen diagnoosi ja hoito IFI-potilailla (1). Antigeenitestaus ei voi ainoastaan ​​helpottaa varhaista diagnoosia, vaan se voi myös estää yleistyneen ylihoidon. Azoulayn ja kollegoiden äskettäinen tutkimus, joka arvioi sienilääkehoitoa yhtenä päivänä useissa ranskalaisissa sairaaloissa, vahvisti, että itse asiassa useimmilla potilailla, jotka saivat sienilääkettä, ei itse asiassa ollut IFI:tä (9). Ylihoito ei ainoastaan ​​lisää kustannuksia merkittävästi (päivittäiset kustannukset useimmilla sienilääkkeillä 600-1000 €), vaan se voi myös johtaa resistenssin kehittymiseen (10). Erittäin herkkien ja spesifisten nopeasti saatavilla olevien antigeenitestien/biomarkkereiden käyttö saattaa ohjata kliinikon aloittamaan sienilääkityksen vain potilailla, jotka hyötyvät hoidosta, koska heillä on todella IFI. Viimeisenä mutta ei vähäisimpänä antigeenitestauksesta voi olla hyötyä myös varhaisen vasteen arvioinnissa, hoidon seurannassa ja hoidon osittamisessa, mukaan lukien päätös, milloin antifungaalinen hoito lopetetaan IA-potilailla (11-12).

   Yksi GM-testin suurimmista rajoituksista on, että aika tuloksiin vaihtelee keskuksien välillä (alle vuorokaudesta useisiin päiviin), pääasiassa riippuen rutiininomaisesti testattujen näytteiden määrästä (koska testi suoritetaan levyillä, jotka kattavat 96 testit) ja etäisyys/kuljetusten kesto kliinisen ympäristön ja laboratorion välillä, jossa testi suoritetaan. Nämä rajoitukset on voitettu Lateral Flow Device Test -testillä, joka on IA:n hoitopistetesti, jonka on kehittänyt professori Thornton Exeterin yliopistosta Iso-Britanniasta. Tämä yhden näytteen testi voidaan tehdä helposti jokaisessa laboratoriossa käyttämällä BAL- ja seeruminäytteitä, ja tuloksen tekemiseen kuluu noin 20 minuuttia. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet testin valtavan potentiaalin ihmisen BAL- ja seeruminäytteissä (13-15). Hyvin tuoreessa tutkimuksessa työryhmämme arvioi LFD-testiä retrospektiivisesti käyttämällä bronkoalveolaarisen huuhtelun (BAL) näytteitä potilailta, joilla oli hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia, ja potilailta kiinteiden elinsiirtojen (SOT) jälkeen. Mukana oli 39 BAL-näytettä 37 potilaalta (29 näytettä hematologisista pahanlaatuisista kasvaimista ja 10 näytettä SOT; 12 todennäköistä IPA:ta, 9 mahdollista IPA:ta, 16 ei IPA:ta). BAL LFD -testin herkkyys ja spesifisyys todennäköiselle IPA:lle olivat 100 % ja 81 %. GM-tasot tapauksissa, joissa LFD oli negatiivinen, olivat merkittävästi alhaisemmat kuin potilailla, joilla oli positiivinen LFD (P <0,0001). Päätimme, että BAL-näytteiden LFD-testi on helppo suorittaa ja antaa tarkat ja nopeasti saatavilla olevat tulokset. Siksi tämä uusi hoitopistetesti voi olla erittäin lupaava diagnostinen lähestymistapa IPA:n havaitsemiseen hematologisista maligniteetti- ja SOT-potilaista peräisin olevista BAL-näytteistä (16). Toinen hiljattain tehty tutkimus osoitti neutropeenisella marsumallilla, että LFD-määritys on toistettavissa eri laboratorioiden ja tutkimusten välillä (17). Monikeskustutkimuksia tarvitaan kuitenkin testin arvioimiseksi edelleen (16).

   Ehdotetussa tutkimuksessa arvioimme BAL Lateral Flow Device Test -testin ja vertaamme tuloksia rutiininomaisesti suoritettuihin galaktomannaaniarvoihin sekä viljely- ja PCR-tuloksiin.

2. Tutkimuksen suunnittelu ja menetelmät 2.1. Tutkimuksen suunnittelu Opintosuunnitelma on tutkiva, retrospektiivinen ja monikeskeinen. Tutkimus alkaa maaliskuussa 2013 ja kestää 13 kuukautta.

   2.2. Opiskelusivustot

   1. Tartuntatautien osasto, Grazin lääketieteellisen yliopiston sisätautien osasto, Itävalta
   2. Hygienian ja lääketieteellisen mikrobiologian osasto, Innsbruckin lääketieteellinen yliopisto, Itävalta
   3. Kliinisen mikrobiologian osasto, Wienin lääketieteellinen yliopisto, Itävalta
   4. Mannheimin yliopistollinen sairaala, Heidelbergin yliopisto, Saksa

   2.3. Tutkimuspopulaatio Kaikki säilytetyt tai rutiininomaisesti saadut BAL-näytteet aikuisilta potilailta, joilla on riski saada invasiivinen keuhkoaspergilloosi, voidaan ottaa mukaan tutkimukseen. Hoitavat lääkärit sokeutuvat BAL Lateral Flow Device -testin tuloksiin, joten testillä ei ole vaikutusta potilaan hallintaan/hoitopäätöksiin. Hoitavat lääkärit sokeutuvat BAL Lateral Flow Device -testin tuloksiin. Siksi testituloksilla ei ole vaikutusta kliinisiin/hoitopäätöksiin, eivätkä ne siksi vaikuta mukana oleviin potilaisiin.

   Perussairaudet, IFI:n EORTC-status (molemmat saatavilla BAL-näytteen mukana tulevasta kliinisestä tilauksesta) ja muut mikrobiologiset/mykologiset testitulokset tallennetaan sähköiseen tietokantaan. Potilaan henkilötietoja ei vaadita.

   2.3.1 Keskeiset sisällyttämiskriteerit

   1. Yli 18-vuotiaat potilaat.
   2. BAL-näyte otettu kliinisen rutiinin aikana.

   3. IFI:n vaarassa (käyvien kliinikkojen mukaan). Riskitekijöitä voivat olla:

      • kuumeinen neutropenia
      • induktiokemoterapia
      • allogeeninen kantasolusiirto/siirre isäntä vastaan ​​-sairaus
      • kliiniset/radiologiset/mykologiset löydökset, jotka ovat epäilyttäviä IFI:lle
      • Kiinteiden elinten siirto
      • ICU-potilas
      • Maksakirroosi 2.3.2 Keskeiset poissulkemiskriteerit
   1. Alle 18-vuotiaat.
   2. Kliinisessä rutiinissa ei saatu BAL-näytettä.

   d.) Ei vaarassa IFI:lle.

   2.4. Lateral Flow Device -testaus Aiemmin kuvattu lateraalivirtauslaite arvioidaan BAL:issa potilailta, joilla on riski saada invasiivinen aspergilloosi. Lyhyesti, immunoglobuliini G (IgG) monoklonaalinen vasta-aine (JF5) solunulkoisen antigeenin epitooppia vastaan, joka erittyy konstitutiivisesti Aspergilluksen aktiivisen kasvun aikana, immobilisoidaan sieppausvyöhykkeelle huokoisella nitroselluloosakalvolla. JF5 IgG on myös konjugoitu kolloidisiin kultahiukkasiin toimimaan havaitsemisreagenssina. BAL-nestettä (100 μl puhdasta näytettä, ilman esikäsittelyä) lisätään vapautustyynyyn, joka sisältää vasta-aine-kulta-konjugaattia, joka sitoi kohdeantigeenin, ja kuljetetaan sitten huokoista kalvoa pitkin ja sitoutuu monoklonaaliseen JF5 IgG-vasta-aineeseen, joka on immobilisoitu sieppausalue. Lateral Flow Device (LFD) -tulokset luetaan 15 minuuttia näytteen lataamisen jälkeen. Sitoutuneet antigeeni-vasta-aine-kulta-kompleksit havaitaan punaisena viivana (T testiä varten), jonka intensiteetti on verrannollinen antigeenikonsentraatioon, ja ne luokiteltiin negatiivisiksi, heikosti positiivisiksi, kohtalaisen positiivisiksi tai voimakkaasti positiivisiksi (kuvio 1). Erilliseen vyöhykkeeseen kalvoon immobilisoitu anti-hiiri-immunoglobuliini (C kontrollia varten) toimii sisäisenä kontrollina (13, 15). Yksityiskohtaiset tuotetiedot löytyvät liitteenä olevasta julkaisusta "Immunokromatografisen lateraalivirtauslaitteen kehittäminen invasiivisen aspergilloosin nopeaan serodiagnostiikkaan" (14).

   Koska laitetta ollaan parhaillaan saamassa CE-merkintää eurooppalaiseen käyttöön lääketieteellisenä diagnostisena laitteena, tämänhetkisiä tuloksia voidaan tarkastella vain monikeskusprototyyppitestien vertailuna (ilman kliinisiä vaikutuksia potilashoitoon).

3. Tilastolliset näkökohdat Tilastollinen analyysi, joka sisältää monimuuttujaanalyysejä, tehdään yhteistyössä mm. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas lääketieteellisen informatiikan, tilastojen ja dokumentoinnin instituutista, Grazin lääketieteellisestä yliopistosta ja Univ. Doz. Mag. Tri Herbert Schwetz, Salzburgin yliopisto.

3.1. Otoskoon laskenta Tutkimussuunnitelman vuoksi tilastollinen otoskoon laskenta ei ole mahdollista. Näytteiden koko on laskettu käyttämällä äskettäin julkaistuja epidemiologisia tietoja mukana olevista keskuksista (3, 16). Ehdotettu tutkittavien potilaiden lukumäärä on edustava ja sopiva lisätutkimuksia varten, ja tilastoneuvoja on katsonut sen riittäväksi.

3.2. Tilastollinen analyysi Tilastollinen analyysi suoritetaan SPSS:n avulla yhteistyössä yllä mainittujen erikoistuneiden yhteistyökumppaniemme kanssa.

Viitteet

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Invasiivisten sieni-infektioiden todellisen taakan aliarviointi hematopoieettisten kantasolusiirtojen vastaanottajilla? Clin Infect Dis. 2010 heinäkuu 15;51(2):253,4; kirjoittajan vastaus 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ et ai. Invasiivisten sieni-infektioiden tuleva seuranta hematopoieettisten kantasolusiirtojen vastaanottajilla, 2001-2006: Yleiskatsaus siirtoon liittyvien infektioiden seurantaverkoston (TRANSNET) tietokantaan. Clin Infect Dis. 2010 huhtikuu 15;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et ai. Galaktomannaanitestauksen vaikutus invasiivisen aspergilloosin esiintyvyyteen potilailla, joilla on hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia. Med Mycol. 2012 huhtikuu;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et ai. Valtakunnallinen itävaltalainen aspergillusrekisteri: Tulevaisuuden tiedonkeruu invasiivisten homeinfektioiden epidemiologiasta, hoidosta ja tuloksista immuunipuutteellisilla ja/tai immuunivastepotilailla. Int J Antimicrob Agents. 2010 joulukuu;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et ai. Kuvantamislöydökset akuutissa invasiivisessa keuhkoaspergilloosissa: Halo-merkin kliininen merkitys. Clin Infect Dis. 2007 Helmikuu 1;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J et ai. Tietokonetomografialla ohjatun perkutaanisen keuhkobiopsian arvo invasiivisen sieni-infektion diagnosoinnissa immuunipuutteellisilla potilailla. Clin Infect Dis. 2007 Oct 1;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et ai. Euroopan syövän/invasiivisten sieni-infektioiden tutkimus- ja hoitojärjestön ja kansallisen allergia- ja tartuntatautiinstituutin mykoosien tutkimusryhmän (EORTC/MSG) konsensusryhmän tarkistetut invasiivisten sienitautien määritelmät. Clin Infect Dis. 2008 Jun 15;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et ai. Eurooppalainen järjestö Cancer/Mycoses-tutkimusryhmän (EORTC/MSG) isäntätekijöiden ja invasiivisten sieni-infektioiden tutkimusta ja hoitoa varten potilailla, joilla on hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia. J Antimikrobinen kemother. 2012 toukokuuta 7.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et ai. Systeeminen antifungaalinen hoito kriittisesti sairaille potilaille, joilla ei ole invasiivista sieni-infektiota*. Crit Care Med. 2012 maaliskuu;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ et ai. Atsoliresistenssin kliiniset vaikutukset aspergillus fumigatusissa, Alankomaat, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 lokakuu;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Seerumin galaktomannaanimäärityksen hyödyllisyys invasiivisen aspergilloosin varhaisen vasteen arvioinnissa ja hoidon kerrostumissa. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29. kesäkuuta 2012; DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ, et ai. Invasiiviset sieni-infektiot potilailla, joilla on hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia korkea-asteen hoidon syöpäkeskuksessa: ruumiinavaustutkimus 15 vuoden ajanjaksolla (1989-2003). Hematologica. 2006 heinäkuu;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Invasiivisen keuhkojen aspergilloosin havaitseminen hematologisilla pahanlaatuisilla potilailla käyttämällä lateraalivirtaustekniikkaa. J Vis Exp. 2012 22. maaliskuuta (61). pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thornton CR. Immunokromatografisen lateraalivirtauslaitteen kehittäminen invasiivisen aspergilloosin nopeaan serodiagnosointiin. Clin Vaccine Immunol. 2008 heinäkuu;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Lateraalivirtausteknologian ja galaktomannaani- ja (1->3)-beeta-D-glukaanimääritysten vertailu invasiivisen keuhkoaspergilloosin havaitsemiseksi. Clin Vaccine Immunol. 2009 joulukuu;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et ai. Bronkoalveolaarinen huuhtelu lateraalivirtauslaitetesti invasiivisen keuhkojen aspergilloosin diagnosoimiseksi hematologisilla pahanlaatuisuuksilla ja kiinteän elinsiirtopotilailla. J Infektoi. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Laboratorioiden ja tutkimustenvälinen uuden lateraalivirtauslaitteen toistettavuus ja antifungaalisen hoidon vaikutus invasiivisen keuhkoaspergilloosin havaitsemiseen. J Clin Microbiol. 2013; epup ennen tulostusta