Bronchoalveolar Lavage Lateral-Flow Device Test för invasiv pulmonell aspergillos: en multicenterstudie

Project Outlook Känsliga och specifika biomarkörer för tidig diagnos av IPA behövs akut för att förbättra överlevnaden. I denna multicenterstudie kommer vi att utvärdera potentialen hos det nya Lateral Flow Device-testet för tidig diagnos av IPA vid sängkanten.

En framgångsrik implementering av studiehypotesen kräver en gedigen bakgrund inom området IPA. Med tanke på detta är jag övertygad om att min yrkeserfarenhet i kombination med den tekniska och vetenskapliga expertisen vid mitt värdinstitut och de tillhörande laboratorierna skapar en mycket konkurrenskraftig och lovande miljö. Framgången för den föreslagna forskningen kommer i hög grad att bero på samarbeten. Under de senaste fyra åren har jag arbetat mycket inom området IPA bland patienter med hemato-onkologiska maligniteter, vilket gjorde att jag kunde etablera de nödvändiga kontakter och samarbeten som är avgörande för projektets framgång. Den största styrkan med denna multicenterstudie är därför samarbetet med tre stora centra för IPA-diagnos under ledning av tre framstående experter (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt och Prof. Willinger) som har publicerat omfattande inom området IPA-diagnos under de senaste åren/decennierna. Jag är säker på att våra resultat kommer att ha långtgående implementeringar för hela IPA-området. Det är klart att de kommer att avsevärt förbättra vår förståelse av den kliniska prestandan för de nya vårdapplikationerna.

Projektet förväntas få stor påverkan på patientvården. Etablering av Lateral Flow Device-testet kan leda till snabbt, uppriktigt sagt på sängkanten, tillgängliga testresultat och kan därför möjliggöra tidigare initiering av lämplig antimykotisk behandling som kan hjälpa till att rädda liv.

1. Bakgrund

   Invasiva svampinfektioner (IFI) är en viktig orsak till sjuklighet och mortalitet bland patienter med hemato-onkologiska maligniteter (1-3). Invasiva mögelinfektioner (IMI), i synnerhet invasiv aspergillos (IA) är den främsta orsaken till IFI bland dessa patienter, följt av invasiva Candida-infektioner (2, 4). På grund av den grova dödligheten på 80-90 % i frånvaro av adekvat behandling, är snabb diagnos och tidig start av svampdödande behandling nyckelfaktorer för framgångsrik behandling av IFI. Olika studier har visat att tidig initiering av svampdödande behandling kan förbättra IFI-överlevnaden till över 80 % (5, 6). Kliniska tecken och symtom på IFI samt radiologiska fynd är dock ofta ospecifika. Oförmågan att konsekvent ställa en tidig och övertygande diagnos förblir därför ett centralt problem. European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) och Mycoses Study Group vid National Institute of Allergy and Infectious Disease (MSG) hade viss framgång med att ta itu med detta problem genom att upprätta konsensusdefinitioner för opportunistiska IFI (7 ). Definitioner i EORTC/MSG-riktlinjerna baserades dock inte bara på genomgång av litteraturen, utan också på expertutlåtanden och efterföljande internationell konsensus. Det främsta skälet var att studier som utvärderade detaljer i definitionerna delvis helt enkelt inte var tillgängliga. I en nyligen genomförd kohortstudie föreslog vår arbetsgrupp några ändringar av kriterierna (8).

   När man använder EORTC/MSG-kriterier beror prevalensen av IFI starkt på mykologiska bevis som inte är lätt att få. Kulturbaserade diagnostiska tillvägagångssätt kräver inte bara invasiva diagnostiska procedurer, som ofta hindras av det allvarliga medicinska tillståndet hos patienter med risk för IFI, utan leder också ofta till falskt negativa resultat. Antigentester med snabbt tillgängliga testresultat har därför blivit allt viktigare för att få fram en realistisk bild av bördan av IFI och möjliggöra tidig diagnos och behandling hos patienter med IFI (1). Antigentestning kan inte bara underlätta tidig diagnos utan kan också förhindra överbehandling som har blivit frekvent. En nyligen genomförd studie av Azoulay och kollegor som utvärderade svampdödande behandling på en dag på flera franska sjukhus bekräftade att de flesta patienter som fick svampdödande medel faktiskt inte hade IFI (9). Överbehandling kan inte bara öka kostnaderna avsevärt (dagliga kostnader för de flesta antimykotika 600-1000€) utan kan också leda till utveckling av resistens (10). Användningen av mycket känsliga och specifika snabbt tillgängliga antigentester/biomarkörer kan vägleda läkaren att initiera svampdödande behandling endast hos patienter som drar nytta av behandlingen eftersom de verkligen har IFI. Sist men inte minst kan antigentestning också vara användbar för tidig responsbedömning, terapiövervakning och behandlingsstratifiering inklusive beslutet när antimykotikabehandling ska avbrytas hos patienter med IA (11-12).

   En av de största begränsningarna med GM-testet är att tiden till resultat varierar mellan centra (mellan mindre än en dag och upp till flera dagar), främst beroende på antalet prover som testas i rutin (eftersom testet utförs med plattor som täcker 96 tester), och avståndet/varaktigheten av transporten mellan den kliniska miljön och laboratoriet där testet utförs. Dessa begränsningar övervinns av Lateral Flow Device Test, ett vårdtest för IA som utvecklats av prof. Thornton vid University of Exeter, Storbritannien. Detta enstaka provtest kan enkelt utföras i varje laboratorium med BAL- och serumprover och tiden till resultatet är cirka 20 minuter. Nyligen genomförda studier har visat testets enorma potential i humana BAL- och serumprover (13-15). I en mycket färsk studie utvärderade vår arbetsgrupp retrospektivt LFD-testet genom att använda bronkoalveolär lavage (BAL) prover från patienter med hematologiska maligniteter och patienter efter solid organtransplantation (SOT). 39 BAL-prover från 37 patienter inkluderades (29 prover av hematologiska maligniteter och 10 prover SOT; 12 sannolika IPA, 9 möjliga IPA, 16 ingen IPA). Sensitiviteten och specificiteten för BAL LFD-testet för trolig IPA var 100 % respektive 81 %. GM-nivåer i fall med negativ LFD var signifikant lägre än hos patienter med positiv LFD (P <0,0001). Vi drog slutsatsen att LFD-testet av BAL-prover utförs enkelt och ger exakta och snabbt tillgängliga resultat. Därför kan detta nya point-of-care-test vara ett mycket lovande diagnostiskt tillvägagångssätt för att detektera IPA i BAL-prover från hematologiska maligniteter och SOT-patienter (16). En annan ny studie visade i en neutropen marsvinsmodell att LFD-analysen är reproducerbar mellan olika laboratorier och studier (17). Flercenterstudier behövs dock för att ytterligare utvärdera testet (16).

   I den föreslagna studien kommer vi att utvärdera BAL Lateral Flow Device Test och jämföra resultat med rutinmässigt utförda Galactomannan-värden samt odlings- och PCR-resultat.

2. Studiens utformning och metoder 2.1. Studiedesign Studiedesignen är utforskande, retrospektiv och multicentrisk. Studien startar i mars 2013 och pågår i 13 månader.

   2.2. Studieplatser

   1. Sektionen för infektionssjukdomar, Institutionen för internmedicin, Medical University of Graz, Österrike
   2. Avdelningen för hygien och medicinsk mikrobiologi, Innsbruck Medical University, Österrike
   3. Avdelningen för klinisk mikrobiologi, medicinska universitetet i Wien, Österrike
   4. Mannheim Universitetssjukhus, Universitetet i Heidelberg, Tyskland

   2.3. Studiepopulation Alla lagrade eller rutinmässigt erhållna BAL-prover från vuxna patienter med risk för invasiv pulmonell aspergillos kommer att vara berättigade till studieinkludering. De behandlande klinikerna kommer att bli blinda för BAL Lateral Flow Devices testresultat och testet kommer därför inte att ha någon inverkan på patienthantering/behandlingsbeslut. De behandlande klinikerna kommer att bli blinda för BAL Lateral Flow Device-testresultat. Testresultaten kommer därför inte att ha någon inverkan på kliniska/behandlingsbeslut och påverkar därför inte de inkluderade patienterna.

   Underliggande sjukdomar, EORTC-status för IFI (båda tillgängliga från den kliniska beställningen som medföljer BAL-provet) och andra mikrobiologiska/mykologiska testresultat kommer att registreras i en elektronisk databas. Inga patientrelaterade personuppgifter kommer att krävas.

   2.3.1 Viktiga inklusionskriterier

   1. Patienter över 18 år.
   2. BAL-prov erhållet i klinisk rutin.

   3. I riskzonen för IFI (enligt behandlande läkare). Riskfaktorer kan inkludera:

      • Febril neutropeni
      • induktionskemoterapi
      • allogen stamcellstransplantation/transplantat kontra värdsjukdom
      • kliniska/radiologiska/mykologiska fynd misstänkta för IFI
      • Solid Organtransplantation
      • ICU-patient
      • Levercirros 2.3.2 Viktiga uteslutningskriterier
   1. Under 18 år.
   2. Inget BAL-prov erhållits i klinisk rutin.

   d.) Inte i riskzonen för IFI.

   2.4. Test av lateralflödesanordning Den tidigare beskrivna laterala flödesanordningen utvärderas i BAL från patienter med risk för invasiv aspergillos. Kortfattat immobiliseras en immunoglobulin G (IgG) monoklonal antikropp (JF5) mot en epitop på ett extracellulärt antigen som utsöndras konstitutivt under aktiv tillväxt av Aspergillus till en infångningszon på ett poröst nitrocellulosamembran. JF5 IgG är också konjugerat till kolloidala guldpartiklar för att fungera som detektionsreagens. BAL-vätska (100 μl rent prov, utan förbehandling) tillsätts till en frisättningsdyna som innehåller antikropp-guldkonjugatet, som band målantigenet, och passerar sedan längs det porösa membranet och binds till JF5 IgG monoklonal antikropp immobiliserad i fångstzonen. Lateral Flow Device (LFD) Resultaten läses av 15 minuter efter att provet laddats. Bundna antigen-antikropp-guldkomplex observeras som en röd linje (T för test) med en intensitet som är proportionell mot antigenkoncentrationen och klassificerades som negativa, svagt positiva, måttligt positiva eller starkt positiva (Fig. 1). Antimus-immunoglobulin immobiliserat på membranet i en separat zon (C för kontroll) fungerar som en intern kontroll (13, 15). Detaljerad produktinformation finns i den bifogade publikationen "Development of an Immunochromatography Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillose" (14).

   Eftersom enheten håller på att CE-märkas för europeisk användning som en medicinsk diagnostisk anordning, kan man bara se de aktuella resultaten som en jämförelse av prototyptest med flera centrum (utan kliniska implikationer för patienthantering).

3. Statistiska överväganden Statistisk analys inklusive multivariatanalys kommer att utföras i samarbete med bl.a. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas från Institutet för medicinsk informatik, statistik och dokumentation, Medical University of Graz och Univ. Doz. Mag. Dr Herbert Schwetz, Salzburgs universitet.

3.1. Beräkning av urvalsstorlek På grund av den explorativa studiedesignen är statistisk beräkning av urvalsstorlek inte möjlig. Provstorleken har beräknats genom att använda nyligen publicerade epidemiologiska data från involverade centra (3, 16). Det föreslagna antalet patienter som ska undersökas är representativt och lämpligt för att generera data för ytterligare studier och har ansetts vara adekvat av den statistiska rådgivaren.

3.2. Statistisk analys Statistisk analys kommer att utföras med hjälp av SPSS i samarbete med våra specialiserade samarbetspartners ovan.

Referenser

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Underskattar den verkliga bördan av invasiva svampinfektioner hos hematopoetiska stamcellstransplanterade mottagare? Clin Infect Dis. 2010 jul 15;51(2):253,4; författarens svar 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ, et al. Prospektiv övervakning för invasiva svampinfektioner hos hematopoetiska stamcellstransplanterade mottagare, 2001-2006: Översikt över databasen för transplantationsassocierad infektionsövervakningsnätverk (TRANSNET). Clin Infect Dis. 2010 apr 15;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et al. Effekten av galaktomannantestning på prevalensen av invasiv aspergillos hos patienter med hematologiska maligniteter. Med Mycol. 2012 apr;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. Det rikstäckande österrikiska aspergillusregistret: En prospektiv datainsamling om epidemiologi, terapi och resultat av invasiva mögelinfektioner hos immunsupprimerade och/eller immunsupprimerade patienter. Int J antimikrobiska medel. 2010 dec;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et al. Avbildningsfynd vid akut invasiv pulmonell aspergillos: Klinisk betydelse av halotecknet. Clin Infect Dis. 2007 1 februari;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. Värdet av datortomografiledd perkutan lungbiopsi för diagnos av invasiv svampinfektion hos immunförsvagade patienter. Clin Infect Dis. 2007 1 okt;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et al. Reviderade definitioner av invasiv svampsjukdom från den europeiska organisationen för forskning och behandling av cancer/invasiva svampinfektioner kooperativa gruppen och det nationella institutet för allergier och infektionssjukdomar mycoses studiegruppen (EORTC/MSG) konsensusgruppen. Clin Infect Dis. 2008 juni 15;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et al. Europeisk organisation för forskning och behandling av Cancer/Mycoses studiegruppen (EORTC/MSG) värdfaktorer och invasiva svampinfektioner hos patienter med hematologiska maligniteter. J Antimicrob Chemother. 7 maj 2012.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et al. Systemisk svampdödande behandling hos kritiskt sjuka patienter utan invasiv svampinfektion*. Crit Care Med. 2012 Mar;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Kliniska implikationer av azolresistens i aspergillus fumigatus, Nederländerna, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 okt;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Användbarheten av serumgalactomannan-analysen för tidig responsbedömning och behandlingsstratifieringar av invasiv aspergillos. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29 juni 2012;DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ, et al. Invasiva svampinfektioner hos patienter med hematologiska maligniteter i ett cancercentrum för tertiärvård: En obduktionsstudie över en 15-årsperiod (1989-2003). Hematologica. 2006 jul;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Detektion av invasiv pulmonell aspergillos hos patienter med hematologisk malignitet genom att använda lateral-flow-teknologi. J Vis Exp. 22 mars 2012;(61). pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thornton CR. Utveckling av en immunokromatografisk sidoflödesanordning för snabb serodiagnos av invasiv aspergillos. Clin Vaccine Immunol. 2008 jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Jämförelse av sidoflödesteknologi och galaktomannan- och (1->3)-beta-D-glukananalyser för detektion av invasiv lungaspergillos. Clin Vaccine Immunol. 2009 dec;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Bronchoalveolar lavage lateral-flow device test för invasiv pulmonell aspergillosdiagnos hos patienter med hematologisk malignitet och solida organtransplantationer. J Infect. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Interlaboratorie- och interstudiereproducerbarhet av en ny lateralt flödesanordning och inverkan av svampdödande terapi på upptäckten av invasiv lungaspergillos. J Clin Microbiol. 2013; epup före tryck