Test del dispositivo di lavaggio broncoalveolare a flusso laterale per l'aspergillosi polmonare invasiva: uno studio multicentrico

Prospettive del progetto Per migliorare la sopravvivenza sono urgentemente necessari biomarcatori sensibili e specifici per la diagnosi precoce dell'IPA. In questo studio multicentrico valuteremo il potenziale del nuovo test del dispositivo a flusso laterale per la diagnosi precoce di IPA al letto del paziente.

Un'implementazione di successo dell'ipotesi degli studi richiede un solido background nel campo dell'IPA. In considerazione di ciò, sono fiducioso che la mia esperienza professionale unita alle competenze tecnico-scientifiche dell'istituto ospitante e dei laboratori associati generi un ambiente altamente competitivo e promettente. Il successo della ricerca proposta dipenderà in modo vitale dalle collaborazioni. Negli ultimi quattro anni ho lavorato a lungo nel campo dell'IPA tra i pazienti con neoplasie emato-oncologiche, che mi ha permesso di stabilire i contatti e le collaborazioni necessarie che sono vitali per il successo del progetto. Il principale punto di forza di questo studio multicentrico è quindi la collaborazione con tre importanti centri per la diagnosi di IPA sotto la guida di tre eminenti esperti (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt e Prof. Willinger) che hanno pubblicato ampiamente nel campo della diagnosi IPA negli ultimi anni/decenni. Sono certo che i nostri risultati avranno implementazioni di vasta portata per l'intero campo dell'IPA. Chiaramente, miglioreranno in modo significativo la nostra comprensione delle prestazioni cliniche delle nuove applicazioni point of care.

Si prevede che il progetto avrà un grande impatto sulla cura del paziente. L'istituzione del test del dispositivo a flusso laterale può portare rapidamente, francamente al capezzale, a risultati del test disponibili e può quindi consentire l'inizio anticipato di un'appropriata terapia antifungina che può aiutare a salvare vite umane.

1. Sfondo

   Le infezioni fungine invasive (IFI) sono un'importante causa di morbilità e mortalità tra i pazienti con neoplasie emato-oncologiche (1-3). Le infezioni da muffe invasive (IMI), in particolare l'aspergillosi invasiva (IA) sono la principale causa di IFI tra questi pazienti, seguite dalle infezioni invasive da Candida (2, 4). A causa della mortalità approssimativa dell'80-90% in assenza di un trattamento adeguato, la diagnosi tempestiva e l'inizio precoce della terapia antimicotica sono fattori chiave per il successo del trattamento dell'IFI. Vari studi hanno dimostrato che l'inizio precoce della terapia antimicotica può migliorare la sopravvivenza dell'IFI fino a oltre l'80% (5, 6). I segni ei sintomi clinici di IFI così come i risultati radiologici, tuttavia, sono spesso aspecifici. L'incapacità di fare una diagnosi precoce e convincente rimane, quindi, un problema centrale. L'Organizzazione europea per la ricerca e il trattamento delle infezioni fungine invasive da cancro (EORTC) e il gruppo di studio sulle micosi dell'Istituto nazionale di allergie e malattie infettive (MSG) hanno avuto un certo successo nell'affrontare questo problema stabilendo definizioni di consenso per IFI opportunistiche (7 ). Tuttavia, le definizioni nelle linee guida EORTC/MSG erano basate non solo sulla revisione della letteratura, ma anche sull'opinione di esperti e sul successivo consenso internazionale. Il motivo principale era che gli studi che valutavano i dettagli delle definizioni erano in parte semplicemente non disponibili. In un recente studio di coorte il nostro gruppo di lavoro ha proposto alcune modifiche ai criteri (8).

   Quando si utilizzano i criteri EORTC/MSG la prevalenza di IFI dipende fortemente dall'evidenza micologica che non è facile da ottenere. Gli approcci diagnostici basati sulla cultura non solo richiedono procedure diagnostiche invasive, che sono spesso ostacolate dalla grave condizione medica nei pazienti a rischio di IFI, ma spesso, di fatto, risultano anche falsamente negativi. Il test dell'antigene con risultati di test rapidamente disponibili è quindi diventato sempre più importante per produrre un quadro realistico dell'onere dell'IFI e consentire una diagnosi e un trattamento precoci nei pazienti con IFI (1). Il test dell'antigene può non solo facilitare la diagnosi precoce, ma può anche prevenire il trattamento eccessivo che è diventato frequente. Un recente studio di Azoulay e colleghi che ha valutato la terapia antimicotica in un giorno in più ospedali francesi ha confermato che in realtà la maggior parte dei pazienti che hanno ricevuto antimicotici non aveva IFI (9). Il trattamento eccessivo può non solo aumentare significativamente i costi (costi giornalieri per la maggior parte degli antimicotici 600-1000 €), ma può anche portare allo sviluppo di resistenza (10). L'uso di test antigenici/biomarcatori altamente sensibili e specifici rapidamente disponibili può guidare il medico a iniziare la terapia antifungina solo nei pazienti che traggono beneficio dal trattamento in quanto realmente affetti da IFI. Ultimo ma non meno importante, il test dell'antigene può essere utile anche per la valutazione precoce della risposta, il monitoraggio della terapia e la stratificazione del trattamento, inclusa la decisione quando interrompere la terapia antifungina nei pazienti con IA (11-12).

   Uno dei principali limiti del test GM è che il tempo per ottenere i risultati varia tra i centri (tra meno di un giorno e fino a diversi giorni), principalmente a seconda del numero di campioni testati di routine (poiché il test viene eseguito con lastre che coprono 96 test) e la distanza/durata del trasporto tra l'ambiente clinico e il laboratorio in cui viene eseguito il test. Queste limitazioni sono superate dal Lateral Flow Device Test, un test point of care per l'IA sviluppato dal Prof. Thornton dell'Università di Exeter, Regno Unito. Questo test su singolo campione può essere facilmente eseguito in ogni laboratorio utilizzando BAL e campioni di siero e il tempo per ottenere il risultato è di circa 20 minuti. Recenti studi hanno dimostrato l'immenso potenziale del test in BAL umano e campioni di siero (13-15). In uno studio molto recente il nostro gruppo di lavoro ha valutato retrospettivamente il test LFD utilizzando campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL) da pazienti con neoplasie ematologiche e pazienti dopo trapianto di organo solido (SOT). Sono stati inclusi trentanove campioni di BAL da 37 pazienti (29 campioni di neoplasie ematologiche e 10 campioni di SOT; 12 probabili IPA, 9 possibili IPA, 16 no IPA). La sensibilità e la specificità del test BAL LFD per la probabile IPA erano rispettivamente del 100% e dell'81%. I livelli di GM nei casi con LFD negativo erano significativamente inferiori rispetto ai pazienti con LFD positivo (P <0,0001). Abbiamo concluso che il test LFD dei campioni BAL viene eseguito facilmente e fornisce risultati accurati e rapidamente disponibili. Pertanto, questo nuovo test point-of-care può essere un approccio diagnostico molto promettente per rilevare l'IPA nei campioni di BAL da pazienti con neoplasie ematologiche e SOT (16). Un altro studio recente ha dimostrato in un modello di cavia neutropenica che il dosaggio LFD è riproducibile tra diversi laboratori e studi (17). Tuttavia, sono necessari studi multicentrici per valutare ulteriormente il test (16).

   Nello studio proposto valuteremo il test del dispositivo a flusso laterale BAL e confronteremo i risultati con i valori di galattomannano eseguiti di routine, nonché i risultati della coltura e della PCR.

2. Disegno e metodi dello studio 2.1. Disegno dello studio Il disegno dello studio è esplorativo, retrospettivo e multicentrico. Lo studio inizierà a marzo 2013 con una durata di 13 mesi.

   2.2. Siti di studio

   1. Sezione di Malattie Infettive, Dipartimento di Medicina Interna, Università di Medicina di Graz, Austria
   2. Divisione di Igiene e Microbiologia Medica, Università di Medicina di Innsbruck, Austria
   3. Divisione di Microbiologia Clinica, Università di Medicina di Vienna, Austria
   4. Ospedale universitario di Mannheim, Università di Heidelberg, Germania

   2.3. Popolazione in studio Tutti i campioni di BAL conservati o ottenuti di routine da pazienti adulti a rischio di aspergillosi polmonare invasiva saranno idonei per l'inclusione nello studio. I medici curanti saranno all'oscuro dei risultati del test del dispositivo a flusso laterale BAL e il test non avrà quindi alcun impatto sulla gestione del paziente/decisioni terapeutiche. I medici curanti saranno all'oscuro dei risultati del test del dispositivo a flusso laterale BAL. I risultati del test non avranno quindi alcun impatto sulle decisioni cliniche/terapeutiche e quindi non influiranno sui pazienti inclusi.

   Le malattie sottostanti, lo stato EORTC dell'IFI (entrambi disponibili dall'ordine clinico che accompagna il campione BAL) e altri risultati dei test microbiologici/micologici saranno registrati in un database elettronico. Non saranno richiesti dati personali relativi al paziente.

   2.3.1 Criteri chiave di inclusione

   1. Pazienti di età superiore ai 18 anni.
   2. Campione BAL ottenuto nella routine clinica.

   3. A rischio di IFI (secondo i medici curanti). I fattori di rischio possono includere:

      • neutropenia febbrile
      • chemioterapia di induzione
      • trapianto/innesto di cellule staminali allogeniche contro malattia dell'ospite
      • reperti clinici/radiologici/micologici sospetti per IFI
      • Trapianto di organi solidi
      • Paziente in terapia intensiva
      • Cirrosi epatica 2.3.2 Principali criteri di esclusione
   1. Minori di 18 anni.
   2. Nessun campione BAL ottenuto nella routine clinica.

   d.) Non a rischio per IFI.

   2.4. Test del dispositivo a flusso laterale Il dispositivo a flusso laterale precedentemente descritto viene valutato nei BAL di pazienti a rischio di aspergillosi invasiva. In breve, un anticorpo monoclonale immunoglobulina G (IgG) (JF5) contro un epitopo su un antigene extracellulare secreto costitutivamente durante la crescita attiva di Aspergillus viene immobilizzato in una zona di cattura su una membrana porosa di nitrocellulosa. JF5 IgG è anche coniugato a particelle d'oro colloidale per fungere da reagente di rilevamento. Il fluido BAL (100 μl di campione puro, senza pretrattamento) viene aggiunto a un tampone di rilascio contenente il coniugato anticorpo-oro, che lega l'antigene target, quindi passa lungo la membrana porosa e si lega all'anticorpo monoclonale IgG JF5 immobilizzato in la zona di cattura. I risultati del dispositivo a flusso laterale (LFD) verranno letti 15 minuti dopo il caricamento del campione. I complessi antigene-anticorpo-oro legati sono osservati come una linea rossa (T per test) con un'intensità proporzionale alla concentrazione di antigene e sono stati classificati come negativi, debolmente positivi, moderatamente positivi o fortemente positivi (Fig. 1). L'immunoglobulina anti-topo immobilizzata sulla membrana in una zona separata (C per il controllo) funge da controllo interno (13, 15). Informazioni dettagliate sul prodotto sono disponibili nella pubblicazione allegata "Development of an Immunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillosis" (14).

   Poiché il dispositivo è in procinto di ottenere la marcatura CE per l'uso europeo come dispositivo diagnostico medico, è possibile visualizzare i risultati attuali solo come un confronto di test su prototipi multicentrici (senza implicazioni cliniche per la gestione del paziente).

3. Considerazioni statistiche L'analisi statistica, comprese le analisi multivariate, sarà eseguita in collaborazione con ao. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dott. tecnico. Josef Haas dell'Institute for Medical Informatics, Statistics and Documentation, Medical University of Graz e Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Università di Salisburgo.

3.1. Calcolo della dimensione del campione A causa del disegno dello studio esplorativo, il calcolo della dimensione del campione statistico non è possibile. La dimensione dei campioni è stata calcolata utilizzando i recenti dati epidemiologici pubblicati dai centri coinvolti (3, 16). Il numero proposto di pazienti da esaminare è rappresentativo e appropriato per generare dati per ulteriori studi ed è stato considerato adeguato dal consulente statistico.

3.2. Analisi statistica L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando SPSS in collaborazione con i nostri collaboratori specializzati sopra menzionati.

Riferimenti

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