Bronchoalveolar Lavage Lateral-Flow Device Test for invasiv pulmonal aspergillose: en multisenterstudie

Prosjektutsikter Sensitive og spesifikke biomarkører for tidlig diagnose av IPA er et presserende behov for å forbedre overlevelsen. I denne multisenterstudien vil vi evaluere potensialet til den nye Lateral Flow Device-testen for tidlig diagnose av IPA ved sengen.

En vellykket implementering av studiehypotesen krever en solid bakgrunn innen IPA-feltet. Med tanke på dette er jeg sikker på at min yrkeserfaring kombinert med den tekniske og vitenskapelige ekspertisen ved vertsinstituttet og de tilknyttede laboratoriene genererer en svært konkurransedyktig og lovende setting. Suksessen til den foreslåtte forskningen vil i stor grad avhenge av samarbeid. I løpet av de siste fire årene har jeg jobbet mye med IPA-feltet blant pasienter med hemato-onkologiske maligniteter, noe som gjorde det mulig for meg å etablere nødvendige kontakter og samarbeid som er avgjørende for prosjektets suksess. Den største styrken til denne multisenterstudien er derfor samarbeidet med tre store sentre for IPA-diagnose under ledelse av tre fremragende eksperter (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt og Prof. Willinger) som har publisert mye innen IPA-diagnose de siste årene/tiårene. Jeg er sikker på at resultatene våre vil ha vidtrekkende implementeringer for hele IPA-feltet. Det er klart at de vil forbedre vår forståelse av den kliniske ytelsen til de nye behandlingsapplikasjonene betydelig.

Prosjektet forventes å ha stor innvirkning på pasientbehandlingen. Etablering av Lateral Flow Device-testen kan føre til raskt, ærlig talt på sengen, tilgjengelige testresultater og kan derfor muliggjøre tidligere oppstart av passende antifungal behandling som kan bidra til å redde liv.

1. Bakgrunn

   Invasive soppinfeksjoner (IFI) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet blant pasienter med hemato-onkologiske maligniteter (1-3). Invasive mugginfeksjoner (IMI), spesielt invasiv aspergillose (IA), er den viktigste årsaken til IFI blant disse pasientene, etterfulgt av invasive Candida-infeksjoner (2, 4). På grunn av den grove dødeligheten på 80-90 % i fravær av adekvat behandling, er rettidig diagnose og tidlig start av antifungal terapi nøkkelfaktorer for vellykket behandling av IFI. Ulike studier har vist at tidlig oppstart av antifungal behandling kan forbedre IFI-overlevelsen til over 80 % (5, 6). Kliniske tegn og symptomer på IFI samt radiologiske funn er imidlertid ofte uspesifikke. Manglende evne til konsekvent å stille en tidlig og overbevisende diagnose forblir derfor ett sentralt problem. European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) og Mycoses Study Group ved National Institute of Allergy and Infectious Disease (MSG) hadde en viss suksess med å takle dette problemet ved å etablere konsensusdefinisjoner for opportunistisk IFI (7 ). Definisjoner i EORTC/MSG-retningslinjer var imidlertid ikke bare basert på gjennomgang av litteraturen, men også ekspertuttalelser og påfølgende internasjonal konsensus. Hovedårsaken var at studier som evaluerte detaljer i definisjonene delvis rett og slett ikke var tilgjengelige. I en nylig kohortstudie foreslo vår arbeidsgruppe noen modifikasjoner av kriteriene (8).

   Ved bruk av EORTC/MSG-kriterier avhenger prevalensen av IFI sterkt av mykologisk bevis som ikke er lett å få tak i. Kulturbaserte diagnostiske tilnærminger krever ikke bare invasive diagnostiske prosedyrer, som ofte hindres av den alvorlige medisinske tilstanden hos pasienter med risiko for IFI, men resulterer faktisk også ofte falskt negative. Antigentesting med raskt tilgjengelige testresultater har derfor blitt stadig viktigere for å gi et realistisk bilde av byrden av IFI og muliggjøre tidlig diagnose og behandling hos pasienter med IFI (1). Antigentesting kan ikke bare lette tidlig diagnose, men kan også forhindre overbehandling som har blitt hyppig. En fersk studie av Azoulay og kolleger som evaluerte soppdrepende terapi på én dag ved flere franske sykehus, bekreftet at faktisk de fleste av pasientene som fikk soppdrepende midler faktisk ikke hadde IFI (9). Overbehandling kan ikke bare øke kostnadene betydelig (daglige kostnader for de fleste soppdrepende midler 600-1000€), men kan også føre til utvikling av resistens (10). Bruken av svært sensitive og spesifikke raskt tilgjengelige antigentester/biomarkører kan veilede klinikeren til å starte soppdrepende terapi kun hos pasienter som drar nytte av behandlingen ettersom de virkelig har IFI. Sist, men ikke minst, kan antigentesting også være nyttig for tidlig responsvurdering, terapiovervåking og behandlingsstratifisering inkludert beslutning om når antifungal behandling skal stoppes hos pasienter med IA (11-12).

   En av de største begrensningene ved GM-testen er at tiden til resultater varierer mellom sentre (mellom mindre enn en dag og opptil flere dager), hovedsakelig avhengig av antall prøver som er testet i rutinen (ettersom testen utføres med plater som dekker 96 tester), og avstanden/varigheten av transporten mellom den kliniske settingen og laboratoriet der testen utføres. Disse begrensningene overvinnes av Lateral Flow Device Test, en behandlingstest for IA utviklet av prof. Thornton ved University of Exeter, Storbritannia. Denne enkeltprøvetesten kan enkelt utføres i hvert laboratorium med BAL- og serumprøver, og tiden til resultatet er omtrent 20 minutter. Nyere studier har vist det enorme potensialet til testen i humane BAL- og serumprøver (13-15). I en helt fersk studie evaluerte arbeidsgruppen vår retrospektivt LFD-testen ved å bruke bronkoalveolar lavage (BAL) prøver fra pasienter med hematologiske maligniteter og pasienter etter solid organtransplantasjon (SOT). Tretti-ni BAL-prøver fra 37 pasienter ble inkludert (29 prøver av hematologiske maligniteter og 10 prøver SOT; 12 sannsynlig IPA, 9 mulig IPA, 16 ingen IPA). Sensitiviteten og spesifisiteten til BAL LFD-testen for sannsynlig IPA var henholdsvis 100 % og 81 %. GM-nivåer i tilfeller med negativ LFD var signifikant lavere enn hos pasienter med positiv LFD (P <0,0001). Vi konkluderte med at LFD-testen av BAL-prøver utføres enkelt og gir nøyaktige og raskt tilgjengelige resultater. Derfor kan denne nye point-of-care testen være en svært lovende diagnostisk tilnærming for å påvise IPA i BAL-prøver fra hematologiske maligniteter og SOT-pasienter (16). En annen nylig studie viste i en nøytropen marsvinmodell at LFD-analysen er reproduserbar mellom ulike laboratorier og studier (17). Multisenterstudier er imidlertid nødvendig for å evaluere testen ytterligere (16).

   I den foreslåtte studien vil vi evaluere BAL Lateral Flow Device Test og sammenligne resultater med rutinemessig utførte Galactomannan-verdier samt kultur- og PCR-resultater.

2. Studiedesign og metoder 2.1. Studiedesign Studiedesignet er utforskende, retrospektivt og multisentrisk. Studiet starter i mars 2013 med en varighet på 13 måneder.

   2.2. Studiesteder

   1. Seksjon for infeksjonssykdommer, Institutt for indremedisin, Medical University of Graz, Østerrike
   2. Avdeling for hygiene og medisinsk mikrobiologi, Innsbruck Medical University, Østerrike
   3. Avdeling for klinisk mikrobiologi, medisinsk universitet i Wien, Østerrike
   4. Mannheim universitetssykehus, Universitetet i Heidelberg, Tyskland

   2.3. Studiepopulasjon Alle lagrede eller rutinemessig innhentede BAL-prøver fra voksne pasienter med risiko for invasiv pulmonal aspergillose vil være kvalifisert for studieinkludering. Behandlende klinikere vil bli blindet for BAL Lateral Flow Device testresultater og testen vil derfor ikke ha noen innvirkning på pasientbehandling/behandlingsbeslutninger. De behandlende klinikerne vil bli blindet for BAL Lateral Flow Device-testresultater. Testresultater vil derfor ikke ha noen innvirkning på kliniske/behandlingsbeslutninger og vil derfor ikke påvirke de inkluderte pasientene.

   Underliggende sykdommer, EORTC-status for IFI (begge tilgjengelig fra den kliniske ordren som følger med BAL-prøven) og andre mikrobiologiske/mykologiske testresultater vil bli registrert i en elektronisk database. Ingen pasientrelaterte personopplysninger kreves.

   2.3.1 Viktige inklusjonskriterier

   1. Pasienter over 18 år.
   2. BAL-prøve innhentet i klinisk rutine.

   3. I fare for IFI (ifølge behandlende klinikere). Risikofaktorer kan omfatte:

      • febril nøytropeni
      • induksjonskjemoterapi
      • allogen stamcelletransplantasjon/transplantat versus vertssykdom
      • kliniske/radiologiske/mykologiske funn mistenkelige for IFI
      • Solid organtransplantasjon
      • ICU pasient
      • Levercirrhose 2.3.2 Viktige eksklusjonskriterier
   1. Under 18 år.
   2. Ingen BAL-prøve tatt i klinisk rutine.

   d.) Ikke i fare for IFI.

   2.4. Lateral Flow Device-testing Den tidligere beskrevne lateral flow-enheten er evaluert i BAL-er fra pasienter med risiko for invasiv aspergillose. Kort fortalt immobiliseres et immunoglobulin G (IgG) monoklonalt antistoff (JF5) mot en epitop på et ekstracellulært antigen som utskilles konstitutivt under aktiv vekst av Aspergillus til en innfangningssone på en porøs nitrocellulosemembran. JF5 IgG er også konjugert til kolloidale gullpartikler for å tjene som deteksjonsreagens. BAL-væske (100 μl ren prøve, uten forbehandling) tilsettes en frigjøringspute som inneholder antistoff-gull-konjugatet, som bandt målantigenet, og deretter ført langs den porøse membranen og bundet til JF5 IgG monoklonalt antistoff immobilisert i fangstsonen. Lateral Flow Device (LFD) Resultatene vil bli lest 15 minutter etter at prøven er lastet. Bundet antigen-antistoff-gullkomplekser er observert som en rød linje (T for test) med en intensitet proporsjonal med antigenkonsentrasjonen og ble klassifisert som negative, svakt positive, moderat positive eller sterkt positive (fig. 1). Anti-mus immunoglobulin immobilisert til membranen i en separat sone (C for kontroll) fungerer som en intern kontroll (13, 15). Detaljert produktinformasjon finnes i den vedlagte publikasjonen "Development of an Immunochromatography Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnose of Invasive Aspergillose" (14).

   Siden enheten er i ferd med å bli CE-merket for europeisk bruk som medisinsk diagnostisk enhet, kan man bare se de nåværende resultatene som en multisenter-prototype-testsammenligning (uten kliniske implikasjoner for pasientbehandling).

3. Statistiske betraktninger Statistisk analyse inkludert multivariate analyser vil bli utført i samarbeid med bl.a. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas fra Institutt for medisinsk informatikk, statistikk og dokumentasjon, Medical University of Graz og Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Universitetet i Salzburg.

3.1. Beregning av prøvestørrelse På grunn av det eksplorative studiedesignet er statistisk beregning av prøvestørrelse ikke mulig. Prøvestørrelsen er beregnet ved å bruke nylig publiserte epidemiologiske data fra involverte sentre (3, 16). Det foreslåtte antallet pasienter som skal undersøkes er representativt og hensiktsmessig for å generere data for videre studier og har blitt ansett for å være tilstrekkelig av den statistiske rådgiveren.

3.2. Statistisk analyse Statistisk analyse vil bli utført ved bruk av SPSS i samarbeid med våre spesialiserte samarbeidspartnere nevnt ovenfor.

Referanser

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Undervurderer den virkelige byrden av invasive soppinfeksjoner hos mottakere av hematopoetiske stamceller? Clin Infect Dis. 2010 Jul 15;51(2):253,4; forfatterens svar 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ, et al. Prospektiv overvåking for invasive soppinfeksjoner hos hematopoetiske stamcelletransplanterte mottakere, 2001-2006: Oversikt over databasen for transplantasjonsassosiert infeksjonsovervåkingsnettverk (TRANSNET). Clin Infect Dis. 15. april 2010;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et al. Effekten av galaktomannan-testing på forekomsten av invasiv aspergillose hos pasienter med hematologiske maligniteter. Med Mycol. 2012 Apr;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. Det landsomfattende østerrikske aspergillus-registeret: En prospektiv datainnsamling om epidemiologi, terapi og utfall av invasive mugginfeksjoner hos immunkompromitterte og/eller immunsupprimerte pasienter. Int J antimikrobielle midler. 2010 Des;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et al. Bildefunn ved akutt invasiv pulmonal aspergillose: Klinisk betydning av halotegnet. Clin Infect Dis. 2007 1. februar;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. Verdien av computertomografi-veiledet perkutan lungebiopsi for diagnose av invasiv soppinfeksjon hos immunkompromitterte pasienter. Clin Infect Dis. 2007 1. okt;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et al. Reviderte definisjoner av invasiv soppsykdom fra den europeiske organisasjonen for forskning og behandling av kreft/invasive soppinfeksjoner samarbeidsgruppe og det nasjonale instituttet for allergi og infeksjonssykdommer mykose studiegruppe (EORTC/MSG) konsensusgruppe. Clin Infect Dis. 2008 Jun 15;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et al. Europeisk organisasjon for forskning og behandling av kreft/mykose studiegruppe (EORTC/MSG) vertsfaktorer og invasive soppinfeksjoner hos pasienter med hematologiske maligniteter. J Antimicrob Chemother. 7. mai 2012.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et al. Systemisk antifungal terapi hos kritisk syke pasienter uten invasiv soppinfeksjon*. Crit Care Med. 2012 Mar;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Kliniske implikasjoner av azolresistens i aspergillus fumigatus, Nederland, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 okt;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Nytten av serum galactomannan-analysen for tidlig responsvurdering og behandlingsstratifikasjoner av invasiv aspergillose. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29. juni 2012;DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ, et al. Invasive soppinfeksjoner hos pasienter med hematologiske maligniteter i et tertiært kreftsenter: En obduksjonsstudie over en 15-årsperiode (1989-2003). Hematologica. 2006 jul;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Påvisning av invasiv pulmonal aspergillose hos pasienter med hematologisk malignitet ved bruk av lateral-flow-teknologi. J Vis Exp. 22. mars 2012;(61). pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thornton CR. Utvikling av en immunokromatografisk sidestrømsenhet for rask serodiagnose av invasiv aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2008 jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Sammenligning av lateral flow-teknologi og galaktomannan og (1->3)-beta-D-glukan-analyser for påvisning av invasiv pulmonal aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2009 Des;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Bronchoalveolar lavage lateral flow device test for invasiv pulmonal aspergillose diagnose hos hematologisk malignitet og solid organtransplanterte pasienter. J Infisere. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Reproduserbarhet mellom laboratorier og interstudier av en ny sidestrømsanordning og påvirkningen av antifungal terapi på påvisning av invasiv lungeaspergillose. J Clin Microbiol. 2013; epup før utskrift