Bronchoalveoläre Lavage Lateral-Flow-Gerätetest für invasive pulmonale Aspergillose: eine multizentrische Studie

Projektausblick Empfindliche und spezifische Biomarker zur Früherkennung von IPA werden dringend benötigt, um das Überleben zu verbessern. In dieser multizentrischen Studie werden wir das Potenzial des neuartigen Lateral Flow Device-Tests für die Frühdiagnose von IPA am Krankenbett bewerten.

Eine erfolgreiche Umsetzung der Studienhypothese erfordert einen soliden Hintergrund im Bereich IPA. In Anbetracht dessen bin ich zuversichtlich, dass meine Berufserfahrung in Kombination mit der technischen und wissenschaftlichen Expertise an meinem Gastinstitut und den angeschlossenen Labors ein äußerst wettbewerbsfähiges und vielversprechendes Umfeld schafft. Der Erfolg der vorgeschlagenen Forschung wird entscheidend von Kooperationen abhängen. In den letzten vier Jahren habe ich intensiv auf dem Gebiet der IPA bei Patienten mit hämato-onkologischen Malignomen gearbeitet, wodurch ich die notwendigen Kontakte und Kooperationen aufbauen konnte, die für den Erfolg des Projekts unerlässlich sind. Die große Stärke dieser multizentrischen Studie ist daher die Zusammenarbeit mit drei großen Zentren für IPA-Diagnostik unter der Leitung von drei herausragenden Experten (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt und Prof. Willinger), die in den letzten Jahren/Jahrzehnten umfangreich auf dem Gebiet der IPA-Diagnostik publiziert haben. Ich bin mir sicher, dass unsere Ergebnisse weitreichende Auswirkungen auf den gesamten Bereich der IPA haben werden. Sie werden unser Verständnis der klinischen Leistung der neuartigen Point-of-Care-Anwendungen eindeutig erheblich verbessern.

Es wird erwartet, dass das Projekt einen großen Einfluss auf die Patientenversorgung haben wird. Die Etablierung des Lateral Flow Device-Tests kann zu schnellen, direkt am Krankenbett verfügbaren Testergebnissen führen und daher einen früheren Beginn einer geeigneten antimykotischen Therapie ermöglichen, die helfen kann, Leben zu retten.

1. Hintergrund

   Invasive Pilzinfektionen (IFI) sind eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit hämato-onkologischen Malignomen (1-3). Invasive Schimmelpilzinfektionen (IMI), insbesondere invasive Aspergillose (IA), sind bei diesen Patienten die Hauptursache für IFI, gefolgt von invasiven Candida-Infektionen (2, 4). Aufgrund der rohen Sterblichkeit von 80–90 % ohne angemessene Behandlung sind eine rechtzeitige Diagnose und ein frühzeitiger Beginn einer antimykotischen Therapie Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Behandlung von IFI. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass ein frühzeitiger Beginn einer antimykotischen Therapie das IFI-Überleben auf über 80 % verbessern kann (5, 6). Klinische Zeichen und Symptome einer IFI sowie radiologische Befunde sind jedoch oft unspezifisch. Die Unfähigkeit, konsequent eine frühe und überzeugende Diagnose zu stellen, bleibt daher ein zentrales Problem. Die European Organization for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) und die Mycoses Study Group des National Institute of Allergy and Infectious Disease (MSG) hatten einige Erfolge bei der Lösung dieses Problems, indem sie Konsensdefinitionen für opportunistische IFI erstellten (7 ). Die Definitionen in den EORTC/MSG-Leitlinien basierten jedoch nicht nur auf der Literaturrecherche, sondern auch auf Expertenmeinungen und einem anschließenden internationalen Konsens. Der Hauptgrund war, dass Studien, die Details der Definitionen auswerten, teilweise einfach nicht verfügbar waren. In einer aktuellen Kohortenstudie schlug unsere Arbeitsgruppe einige Modifikationen der Kriterien vor (8).

   Bei Verwendung von EORTC/MSG-Kriterien hängt die Prävalenz von IFI stark von mykologischen Beweisen ab, die nicht leicht zu bekommen sind. Kulturbasierte diagnostische Ansätze erfordern nicht nur invasive diagnostische Verfahren, die oft durch den schweren medizinischen Zustand bei Patienten mit IFI-Risiko behindert werden, sondern führen tatsächlich häufig auch zu falsch negativen Ergebnissen. Antigentests mit schnell verfügbaren Testergebnissen werden daher immer wichtiger, um ein realistisches Bild der Belastung durch IFI zu zeichnen und eine frühzeitige Diagnose und Behandlung von Patienten mit IFI zu ermöglichen (1). Antigentests können nicht nur eine frühzeitige Diagnose erleichtern, sondern auch eine häufig gewordene Überbehandlung verhindern. Eine aktuelle Studie von Azoulay und Kollegen, die die Antimykotika-Therapie an einem Tag in mehreren französischen Krankenhäusern bewerteten, bestätigte, dass die meisten Patienten, die Antimykotika erhielten, tatsächlich keine IFI hatten (9). Eine Überbehandlung kann nicht nur die Kosten erheblich erhöhen (tägliche Kosten für die meisten Antimykotika 600-1000 €), sondern auch zur Entwicklung von Resistenzen führen (10). Die Verwendung hochsensibler und spezifischer, schnell verfügbarer Antigentests/Biomarker kann den Arzt dazu anleiten, eine antimykotische Therapie nur bei Patienten einzuleiten, die von der Behandlung profitieren, da sie wirklich IFI haben. Nicht zuletzt können Antigentests auch für die Beurteilung des frühen Ansprechens, die Therapieüberwachung und die Behandlungsstratifizierung nützlich sein, einschließlich der Entscheidung, wann die antimykotische Therapie bei Patienten mit IA beendet werden soll (11-12).

   Eine der größten Einschränkungen des GM-Tests besteht darin, dass die Zeit bis zu den Ergebnissen zwischen den Zentren variiert (zwischen weniger als einem Tag und bis zu mehreren Tagen), hauptsächlich abhängig von der Anzahl der routinemäßig getesteten Proben (da der Test mit Platten durchgeführt wird, die 96 Tests) und die Entfernung/Dauer des Transports zwischen dem klinischen Umfeld und dem Labor, in dem der Test durchgeführt wird. Diese Einschränkungen werden durch den Lateral Flow Device Test, einen Point-of-Care-Test für IA, der von Prof. Thornton von der University of Exeter, Vereinigtes Königreich, entwickelt wurde, überwunden. Dieser Einzelprobentest kann problemlos in jedem Labor mit BAL- und Serumproben durchgeführt werden und die Zeit bis zum Ergebnis beträgt etwa 20 Minuten. Jüngste Studien haben das immense Potenzial des Tests in menschlichen BAL- und Serumproben gezeigt (13-15). In einer sehr aktuellen Studie hat unsere Arbeitsgruppe den LFD-Test retrospektiv anhand von Proben aus bronchoalveolärer Lavage (BAL) von Patienten mit hämatologischen Malignomen und Patienten nach solider Organtransplantation (SOT) evaluiert. Neununddreißig BAL-Proben von 37 Patienten wurden eingeschlossen (29 Proben hämatologische Malignome und 10 Proben SOT; 12 wahrscheinliche IPA, 9 mögliche IPA, 16 keine IPA). Sensitivität und Spezifität des BAL-LFD-Tests für wahrscheinliche IPA betrugen 100 % bzw. 81 %. Die GM-Spiegel waren in Fällen mit negativem LFD signifikant niedriger als bei Patienten mit positivem LFD (p < 0,0001). Wir kamen zu dem Schluss, dass der LFD-Test von BAL-Proben einfach durchzuführen ist und genaue und schnell verfügbare Ergebnisse liefert. Daher könnte dieser neue Point-of-Care-Test ein sehr vielversprechender diagnostischer Ansatz zum Nachweis von IPA in BAL-Proben von hämatologischen Malignomen und SOT-Patienten sein (16). Eine weitere kürzlich durchgeführte Studie zeigte in einem neutropenischen Meerschweinchenmodell, dass der LFD-Assay zwischen verschiedenen Labors und Studien reproduzierbar ist (17). Zur weiteren Evaluation des Tests sind jedoch multizentrische Studien erforderlich (16).

   In der vorgeschlagenen Studie werden wir den BAL Lateral Flow Device Test evaluieren und die Ergebnisse mit routinemäßig durchgeführten Galactomannan-Werten sowie Kultur- und PCR-Ergebnissen vergleichen.

2. Studiendesign und Methoden 2.1. Studiendesign Das Studiendesign ist explorativ, retrospektiv und multizentrisch. Die Studie beginnt im März 2013 mit einer Dauer von 13 Monaten.

   2.2. Studienorte

   1. Abteilung für Infektionskrankheiten, Klinik für Innere Medizin, Medizinische Universität Graz, Österreich
   2. Abteilung für Hygiene und medizinische Mikrobiologie, Medizinische Universität Innsbruck, Österreich
   3. Abteilung für Klinische Mikrobiologie, Medizinische Universität Wien, Österreich
   4. Universitätsklinikum Mannheim, Universität Heidelberg, Deutschland

   2.3. Studienpopulation Alle gelagerten oder routinemäßig entnommenen BAL-Proben von erwachsenen Patienten mit einem Risiko für invasive pulmonale Aspergillose kommen für die Aufnahme in die Studie in Frage. Die behandelnden Kliniker sind für die Testergebnisse des BAL Lateral Flow Device blind, und der Test hat daher keinen Einfluss auf das Patientenmanagement / Behandlungsentscheidungen. Die behandelnden Ärzte sind für die Testergebnisse des BAL Lateral Flow Device blind. Die Testergebnisse haben daher keinen Einfluss auf klinische Entscheidungen/Behandlungsentscheidungen und wirken sich daher nicht auf die eingeschlossenen Patienten aus.

   Grunderkrankungen, EORTC-Status von IFI (beides verfügbar aus dem der BAL-Probe beiliegenden klinischen Auftrag) und andere mikrobiologische/mykologische Untersuchungsergebnisse werden in einer elektronischen Datenbank erfasst. Es werden keine patientenbezogenen personenbezogenen Daten benötigt.

   2.3.1 Wichtige Aufnahmekriterien

   1. Patienten über 18 Jahre.
   2. In der klinischen Routine gewonnene BAL-Probe.

   3. IFI-Risiko (laut behandelnden Ärzten). Risikofaktoren können sein:

      • febrile Neutropenie
      • Induktionschemotherapie
      • allogene Stammzelltransplantation/Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit
      • klinische/radiologische/mykologische Befunde verdächtig für IFI
      • Transplantation solider Organe
      • Patient auf der Intensivstation
      • Leberzirrhose 2.3.2 Wichtige Ausschlusskriterien
   1. Unter 18 Jahren.
   2. Keine BAL-Probe in der klinischen Routine erhalten.

   d.) Nicht gefährdet für IFI.

   2.4. Testen des Lateral-Flow-Geräts Das zuvor beschriebene Lateral-Flow-Gerät wird in BALs von Patienten mit einem Risiko für invasive Aspergillose bewertet. Kurz gesagt, ein monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper (JF5) gegen ein Epitop auf einem extrazellulären Antigen, das konstitutiv während des aktiven Wachstums von Aspergillus sezerniert wird, wird an einer Einfangzone auf einer porösen Nitrozellulosemembran immobilisiert. JF5 IgG wird auch an kolloidale Goldpartikel konjugiert, um als Nachweisreagenz zu dienen. BAL-Flüssigkeit (100 μl der unverdünnten Probe, ohne Vorbehandlung) wird auf ein Trennkissen gegeben, das das Antikörper-Gold-Konjugat enthält, das das Zielantigen gebunden hat, und dann entlang der porösen Membran geleitet und an den darin immobilisierten monoklonalen JF5-IgG-Antikörper gebunden die Fangzone. Die Ergebnisse des Lateral Flow Device (LFD) werden 15 Minuten nach dem Laden der Probe abgelesen. Gebundene Antigen-Antikörper-Gold-Komplexe werden als rote Linie (T für Test) mit einer Intensität proportional zur Antigenkonzentration beobachtet und wurden als negativ, schwach positiv, mäßig positiv oder stark positiv klassifiziert (Abb. 1). Anti-Maus-Immunglobulin, das in einer separaten Zone (C für Kontrolle) an der Membran immobilisiert ist, dient als interne Kontrolle (13, 15). Detaillierte Produktinformationen finden sich in der beigefügten Publikation „Development of an Immunochromatographic Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillose“ (14).

   Da sich das Gerät im Prozess der CE-Kennzeichnung für den europäischen Einsatz als medizinisches Diagnosegerät befindet, kann man die aktuellen Ergebnisse nur als multizentrischen Prototypentestvergleich ansehen (ohne klinische Auswirkungen auf das Patientenmanagement).

3. Statistische Überlegungen Statistische Analysen einschließlich multivariater Analysen werden in Zusammenarbeit mit ao durchgeführt. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas vom Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Dokumentation, Medizinische Universität Graz und Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Universität Salzburg.

3.1. Fallzahlberechnung Aufgrund des explorativen Studiendesigns ist eine statistische Fallzahlberechnung nicht möglich. Die Stichprobengröße wurde anhand kürzlich veröffentlichter epidemiologischer Daten der beteiligten Zentren berechnet (3, 16). Die vorgeschlagene Anzahl der zu untersuchenden Patienten ist repräsentativ und geeignet, um Daten für weitere Studien zu generieren, und wurde vom statistischen Berater als angemessen erachtet.

3.2. Statistische Analyse Die statistische Analyse wird unter Verwendung von SPSS in Zusammenarbeit mit unseren oben erwähnten spezialisierten Kooperationspartnern durchgeführt.

Verweise

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Unterschätzung der tatsächlichen Belastung durch invasive Pilzinfektionen bei Empfängern von hämatopoetischen Stammzelltransplantaten? Clin Infect Dis. 15. Juli 2010;51(2):253,4; Autor Antwort 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ, et al. Prospektive Überwachung invasiver Pilzinfektionen bei Empfängern von hämatopoetischen Stammzellentransplantaten, 2001-2006: Überblick über die Datenbank des Transplantations-assoziierten Infektionsüberwachungsnetzwerks (TRANSNET). Clin Infect Dis. 15. April 2010;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Wölfler A, et al. Einfluss von Galactomannan-Tests auf die Prävalenz von invasiver Aspergillose bei Patienten mit hämatologischen Malignomen. Med. Mycol. 2012 Apr;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. Das österreichweite Aspergillus-Register: Eine prospektive Datenerhebung zu Epidemiologie, Therapie und Verlauf invasiver Schimmelpilzinfektionen bei immunsupprimierten und/oder immunsupprimierten Patienten. Int J Antimicrob Agents. 2010 Dez;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et al. Bildgebende Befunde bei akuter invasiver pulmonaler Aspergillose: Klinische Bedeutung des Halo-Zeichens. Clin Infect Dis. 1. Februar 2007;44(3):373-9.
6. C. Lass-Florl, G. Resch, D. Nachbaur, A. Mayr, G. Gastl, J. Auberger, et al. Der Wert der Computertomographie-geführten perkutanen Lungenbiopsie zur Diagnose einer invasiven Pilzinfektion bei immungeschwächten Patienten. Clin Infect Dis. 1. Okt. 2007;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et al. Überarbeitete Definitionen von invasiven Pilzerkrankungen der European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group und der National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clin Infect Dis. 15. Juni 2008;46(12):1813-21.
8. Hoenigl, M., Strenger, V., Buzina, W., Valentin, T., Koidl, C., Wölfler, A., et al. Europäische Organisation für die Erforschung und Behandlung von Krebs-/Mykosen-Studiengruppen (EORTC/MSG) Wirtsfaktoren und invasive Pilzinfektionen bei Patienten mit hämatologischen Malignomen. J Antimicrob Chemother. 7. Mai 2012.
9. Azoulay E., Dupont H., Tabah A., Lortholary O., Stahl JP, Francais A., et al. Systemische antimykotische Therapie bei kritisch kranken Patienten ohne invasive Pilzinfektion*. Crit Care Med. März 2012;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Klinische Auswirkungen der Azolresistenz bei Aspergillus fumigatus, Niederlande, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 Oct;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Nützlichkeit des Serum-Galactomannan-Assays für die Bewertung des frühen Ansprechens und Behandlungsstratifizierungen von invasiver Aspergillose. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29. Juni 2012;DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. G. Chamilos, M. Luna, RE Lewis, GP Bodey, R. Chemaly, JJ Tarrand et al. Invasive Pilzinfektionen bei Patienten mit hämatologischen Malignomen in einem Krebszentrum der Tertiärversorgung: Eine Autopsiestudie über einen Zeitraum von 15 Jahren (1989-2003). Hämatologica. 2006 Jul;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Nachweis der invasiven pulmonalen Aspergillose bei Patienten mit hämatologischer Malignität mithilfe der Lateral-Flow-Technologie. J Vis Exp. 22. März 2012;(61). pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thornton CR. Entwicklung eines immunchromatographischen Lateral-Flow-Geräts zur schnellen Serodiagnostik invasiver Aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2008 Jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Vergleich der Lateral-Flow-Technologie und Galactomannan- und (1->3)-beta-D-Glucan-Assays zum Nachweis von invasiver pulmonaler Aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2009 Dez;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Bronchoalveoläre Lavage-Lateral-Flow-Gerätetest für die Diagnose einer invasiven pulmonalen Aspergillose bei hämatologischen Malignomen und Patienten mit soliden Organtransplantationen. J Infizieren. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Inter-Labor- und Inter-Studien-Reproduzierbarkeit eines neuartigen Lateral-Flow-Geräts und der Einfluss einer antimykotischen Therapie auf die Erkennung von invasiver pulmonaler Aspergillose. J Clin Microbiol. 2013; epup vor dem Druck