Teste de dispositivo de fluxo lateral de lavagem broncoalveolar para aspergilose pulmonar invasiva: um estudo multicêntrico

Perspectiva do Projeto Biomarcadores sensíveis e específicos para o diagnóstico precoce de IPA são necessários com urgência para melhorar a sobrevida. Neste estudo multicêntrico, avaliaremos o potencial do novo teste do Dispositivo de Fluxo Lateral para o diagnóstico precoce de API à beira do leito.

Uma implementação bem-sucedida da hipótese de estudos requer uma sólida formação no campo da IPA. Diante disso, estou confiante de que minha experiência profissional combinada com o conhecimento técnico e científico do meu instituto anfitrião e dos laboratórios associados gera um ambiente altamente competitivo e promissor. O sucesso da pesquisa proposta dependerá vitalmente de colaborações. Nos últimos quatro anos, trabalhei extensivamente na área de IPA em pacientes com neoplasias hemato-oncológicas, o que me permitiu estabelecer os contatos e cooperações necessários e vitais para o sucesso do projeto. A principal força deste estudo multicêntrico é, portanto, a cooperação com três grandes centros de diagnóstico de IPA sob a liderança de três especialistas de destaque (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt e Prof. Willinger) que publicaram extensivamente no campo do diagnóstico de IPA nos últimos anos/décadas. Tenho certeza de que nossos resultados terão implementações de longo alcance para todo o campo da IPA. Claramente, eles irão avançar significativamente nossa compreensão do desempenho clínico das novas aplicações de ponto de atendimento.

Espera-se que o projeto tenha um grande impacto no atendimento ao paciente. O estabelecimento do teste do Dispositivo de Fluxo Lateral pode levar a resultados de teste disponíveis rapidamente, francamente à beira do leito, e pode, portanto, permitir o início precoce da terapia antifúngica apropriada, que pode ajudar a salvar vidas.

1. Fundo

   Infecções fúngicas invasivas (IFI) são uma importante causa de morbidade e mortalidade entre pacientes com malignidades hemato-oncológicas (1-3). Infecções fúngicas invasivas (IMI), em particular aspergilose invasiva (AI), são a principal causa de IFI entre esses pacientes, seguidas por infecções invasivas por Candida (2, 4). Devido à mortalidade bruta de 80-90% na ausência de tratamento adequado, o diagnóstico oportuno e o início precoce da terapia antifúngica são fatores-chave no tratamento bem-sucedido da IFI. Vários estudos mostraram que o início precoce da terapia antifúngica pode melhorar a sobrevida da IFI para mais de 80% (5, 6). Sinais e sintomas clínicos de IFI, bem como achados radiológicos, no entanto, muitas vezes são inespecíficos. A incapacidade de fazer consistentemente um diagnóstico precoce e convincente permanece, portanto, um problema central. A Organização Européia para Pesquisa e Tratamento de Infecções Fúngicas Invasivas do Câncer Grupo Cooperativo (EORTC) e o Grupo de Estudo de Micoses do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (MSG) tiveram algum sucesso em lidar com este problema estabelecendo definições de consenso para IFI oportunista (7 ). No entanto, as definições nas diretrizes do EORTC/MSG foram baseadas não apenas na revisão da literatura, mas também na opinião de especialistas e no subsequente consenso internacional. A principal razão foi que, em parte, os estudos que avaliavam os detalhes das definições simplesmente não estavam disponíveis. Em um estudo de coorte recente, nosso grupo de trabalho propôs algumas modificações nos critérios (8).

   Ao usar os critérios EORTC/MSG, a prevalência de IFI depende fortemente da evidência micológica que não é fácil de obter. Abordagens diagnósticas baseadas em cultura não requerem apenas procedimentos diagnósticos invasivos, que muitas vezes são prejudicados pela condição médica grave em pacientes com risco de IFI, mas também, de fato, frequentemente resultam falsamente negativos. O teste de antígeno com resultados de teste rapidamente disponíveis tornou-se cada vez mais importante para produzir uma imagem realista da carga de IFI e permitir diagnóstico e tratamento precoces em pacientes com IFI (1). O teste de antígeno pode não apenas facilitar o diagnóstico precoce, mas também prevenir o tratamento excessivo que se tornou frequente. Um estudo recente de Azoulay e colegas que avaliaram a terapia antifúngica em um dia em vários hospitais franceses confirmou que, de fato, a maioria dos pacientes que receberam antifúngicos não tinha IFI (9). O tratamento excessivo pode não apenas aumentar significativamente os custos (custos diários para a maioria dos antifúngicos 600-1000 €), mas também pode levar ao desenvolvimento de resistência (10). O uso de testes de antígenos/biomarcadores altamente sensíveis e específicos e rapidamente disponíveis pode orientar o clínico a iniciar a terapia antifúngica apenas em pacientes que se beneficiam do tratamento, pois realmente têm IFI. Por último, mas não menos importante, o teste de antígeno também pode ser útil para avaliação de resposta precoce, monitoramento de terapia e estratificação de tratamento, incluindo a decisão de quando interromper a terapia antifúngica em pacientes com IA (11-12).

   Uma das maiores limitações do teste GM é que o tempo para o resultado varia entre os centros (entre menos de um dia e até vários dias), dependendo principalmente do número de amostras testadas na rotina (já que o teste é feito com placas que cobrem 96 testes) e a distância/duração do transporte entre o ambiente clínico e o laboratório onde o teste é realizado. Essas limitações são superadas pelo Teste de Dispositivo de Fluxo Lateral, um teste de ponto de atendimento para IA desenvolvido pelo Prof. Thornton da Universidade de Exeter, Reino Unido. Este teste de amostra única pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório usando BAL e amostras de soro e o tempo para resultado é de aproximadamente 20 minutos. Estudos recentes mostraram o imenso potencial do teste em amostras de soro e LBA humanas (13-15). Em um estudo muito recente, nosso grupo de trabalho avaliou retrospectivamente o teste LFD usando amostras de lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes com malignidades hematológicas e pacientes após transplante de órgãos sólidos (TOS). Trinta e nove amostras de BAL de 37 pacientes foram incluídas (29 amostras de malignidades hematológicas e 10 amostras de SOT; 12 IPA provável, 9 IPA possível, 16 sem IPA). A sensibilidade e a especificidade do teste BAL LFD para IPA provável foram de 100% e 81%, respectivamente. Os níveis de GM em casos com LFD negativo foram significativamente menores do que em pacientes com LFD positivo (P <0,0001). Concluímos que o teste LFD de espécimes BAL é realizado facilmente e fornece resultados precisos e rapidamente disponíveis. Portanto, este novo teste de ponto de atendimento pode ser uma abordagem diagnóstica muito promissora para detectar IPA em amostras de BAL de malignidade hematológica e pacientes com TOS (16). Outro estudo recente demonstrou em um modelo de cobaia neutropênica que o ensaio LFD é reprodutível entre diferentes laboratórios e estudos (17). Estudos multicêntricos são necessários, no entanto, para avaliar melhor o teste (16).

   No estudo proposto iremos avaliar o Teste de Dispositivo de Fluxo Lateral BAL e comparar os resultados com valores de galactomanana realizados rotineiramente, bem como resultados de cultura e PCR.

2. Desenho do estudo e métodos 2.1. Desenho do estudo O desenho do estudo é exploratório, retrospectivo e multicêntrico. O estudo terá início em março de 2013 com duração de 13 meses.

   2.2. locais de estudo

   1. Seção de Doenças Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Universidade Médica de Graz, Áustria
   2. Divisão de Higiene e Microbiologia Médica, Universidade Médica de Innsbruck, Áustria
   3. Divisão de Microbiologia Clínica, Universidade Médica de Viena, Áustria
   4. Hospital Universitário de Mannheim, Universidade de Heidelberg, Alemanha

   2.3. População do estudo Todas as amostras de BAL armazenadas ou obtidas rotineiramente de pacientes adultos com risco de aspergilose pulmonar invasiva serão elegíveis para inclusão no estudo. Os médicos assistentes não terão conhecimento dos resultados do teste do Dispositivo de Fluxo Lateral BAL e, portanto, o teste não terá impacto nas decisões de gerenciamento/tratamento do paciente. Os médicos assistentes serão cegos para os resultados do teste do dispositivo de fluxo lateral BAL. Os resultados dos testes não terão, portanto, impacto nas decisões clínicas/de tratamento e, portanto, não afetarão os pacientes incluídos.

   Doenças subjacentes, status EORTC de IFI (ambos disponíveis no pedido clínico que acompanha a amostra BAL) e outros resultados de testes microbiológicos/micológicos serão registrados em um banco de dados eletrônico. Nenhum dado pessoal relacionado ao paciente será necessário.

   2.3.1 Principais critérios de inclusão

   1. Pacientes acima de 18 anos de idade.
   2. Amostra de LBA obtida na rotina clínica.

   3. Em risco de IFI (de acordo com os médicos assistentes). Os fatores de risco podem incluir:

      • neutropenia febril
      • quimioterapia de indução
      • transplante alogênico de células-tronco/enxerto versus doença do hospedeiro
      • achados clínicos/radiológicos/micológicos suspeitos de IFI
      • Transplante de órgãos sólidos
      • paciente de UTI
      • Cirrose hepática 2.3.2 Principais critérios de exclusão
   1. Menores de 18 anos.
   2. Nenhuma amostra de LBA obtida na rotina clínica.

   d.) Não corre risco de IFI.

   2.4. Teste do dispositivo de fluxo lateral O dispositivo de fluxo lateral descrito anteriormente é avaliado em BALs de pacientes com risco de aspergilose invasiva. Resumidamente, um anticorpo monoclonal de imunoglobulina G (IgG) (JF5) para um epítopo em um antígeno extracelular secretado constitutivamente durante o crescimento ativo de Aspergillus é imobilizado em uma zona de captura em uma membrana porosa de nitrocelulose. JF5 IgG também é conjugado com partículas de ouro coloidal para servir como reagente de detecção. O fluido BAL (100 μl de amostra pura, sem pré-tratamento) é adicionado a uma almofada de liberação contendo o conjugado anticorpo-ouro, que liga o antígeno alvo e, em seguida, passa pela membrana porosa e liga-se ao anticorpo monoclonal JF5 IgG imobilizado em a zona de captura. Os resultados do dispositivo de fluxo lateral (LFD) serão lidos 15 minutos após o carregamento da amostra. Os complexos antígeno-anticorpo-ouro ligados são observados como uma linha vermelha (T de teste) com intensidade proporcional à concentração do antígeno e foram classificados como negativos, fracamente positivos, moderadamente positivos ou fortemente positivos (fig. 1). A imunoglobulina anti-camundongo imobilizada na membrana em uma zona separada (C para controle) serve como controle interno (13, 15). Informações detalhadas sobre o produto podem ser encontradas na publicação anexa "Desenvolvimento de um dispositivo imunocromatográfico de fluxo lateral para sorodiagnóstico rápido de aspergilose invasiva" (14).

   Como o dispositivo está em processo de marcação CE para uso europeu como dispositivo de diagnóstico médico, só podemos ver os resultados atuais como uma comparação de teste de protótipo multicêntrico (sem implicações clínicas para o gerenciamento do paciente).

3. Considerações estatísticas A análise estatística, incluindo análises multivariadas, será realizada em cooperação com ao. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. técnico. Josef Haas do Instituto de Informática Médica, Estatística e Documentação, Universidade Médica de Graz e Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Universidade de Salzburg.

3.1. Cálculo do tamanho da amostra Devido ao desenho do estudo exploratório, o cálculo estatístico do tamanho da amostra não é possível. O tamanho das amostras foi calculado usando dados epidemiológicos publicados recentemente dos centros envolvidos (3, 16). O número proposto de pacientes a serem investigados é representativo e adequado para gerar dados para estudos posteriores e foi considerado adequado pelo consultor estatístico.

3.2. Análise estatística A análise estatística será realizada usando o SPSS em cooperação com nossos cooperadores especializados mencionados acima.

Referências

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Subestimando a carga real de infecções fúngicas invasivas em receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas? Clin Infect Dis. 15 de julho de 2010;51(2):253,4; resposta do autor 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ, et al. Vigilância prospectiva para infecções fúngicas invasivas em receptores de transplante de células-tronco hematopoiéticas, 2001-2006: Visão geral do banco de dados da rede de vigilância de infecções associadas ao transplante (TRANSNET). Clin Infect Dis. 15 de abril de 2010;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et al. Impacto do teste de galactomanana na prevalência de aspergilose invasiva em pacientes com neoplasias hematológicas. Med Mycol. 2012 abr;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. O registro nacional austríaco de aspergillus: uma coleta prospectiva de dados sobre epidemiologia, terapia e resultado de infecções invasivas por fungos em pacientes imunocomprometidos e/ou imunossuprimidos. Int J Agentes Antimicrobianos. 2010 dez;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et al. Achados de imagem na aspergilose pulmonar aguda invasiva: significado clínico do sinal do halo. Clin Infect Dis. 1 de fevereiro de 2007;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. O valor da biópsia pulmonar percutânea guiada por tomografia computadorizada para o diagnóstico de infecção fúngica invasiva em pacientes imunocomprometidos. Clin Infect Dis. 1 de outubro de 2007;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et al. Definições revisadas de doenças fúngicas invasivas da Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Grupo Cooperativo de Câncer/Infecções Fúngicas Invasivas e Grupo de Consenso do Grupo de Estudo de Micoses do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (EORTC/MSG). Clin Infect Dis. 15 de junho de 2008;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et al. Organização europeia para a pesquisa e tratamento de fatores do hospedeiro do grupo de estudos de câncer/micoses (EORTC/MSG) e infecções fúngicas invasivas em pacientes com neoplasias hematológicas. J Antimicrob Chemother. 7 de maio de 2012.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et al. Terapia antifúngica sistêmica em pacientes críticos sem infecção fúngica invasiva*. Crit Care Med. 2012 mar;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Implicações clínicas da resistência a azóis em Aspergillus fumigatus, Holanda, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 out;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Utilidade do ensaio de galactomanana sérica para avaliação de resposta precoce e estratificações de tratamento de aspergilose invasiva. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29 de junho de 2012; DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ, et al. Infecções fúngicas invasivas em pacientes com neoplasias hematológicas em um centro terciário de câncer: um estudo de autópsia durante um período de 15 anos (1989-2003). Hematologica. 2006 jul;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com malignidade hematológica usando tecnologia de fluxo lateral. J Vis Exp. 22 de março de 2012;(61). Pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thorton CR. Desenvolvimento de um dispositivo imunocromatográfico de fluxo lateral para sorodiagnóstico rápido de aspergilose invasiva. Clin Vaccine Immunol. 2008 jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Comparação da tecnologia de fluxo lateral e ensaios de galactomanana e (1->3)-beta-D-glucana para detecção de aspergilose pulmonar invasiva. Clin Vaccine Immunol. 2009 dez;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Lavagem broncoalveolar teste de dispositivo de fluxo lateral para diagnóstico de aspergilose pulmonar invasiva em malignidade hematológica e pacientes com transplante de órgãos sólidos. J Infectar. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Reprodutibilidade interlaboratorial e interestudo de um novo dispositivo de fluxo lateral e a influência da terapia antifúngica na detecção de aspergilose pulmonar invasiva. J Clin Microbiol. 2013; epup antes da impressão