Bronchoalveolar Lavage Lateral-Flow Device Test for invasiv pulmonal aspergillose: en multicenterundersøgelse

Project Outlook Sensitive og specifikke biomarkører til tidlig diagnose af IPA er et presserende behov for at forbedre overlevelsen. I dette multicenterstudie vil vi evaluere potentialet af den nye Lateral Flow Device-test til tidlig diagnose af IPA ved sengekanten.

En vellykket implementering af studiehypotesen kræver en solid baggrund inden for IPA-området. I betragtning af dette er jeg overbevist om, at min faglige erfaring kombineret med den tekniske og videnskabelige ekspertise på mit værtsinstitut og de tilknyttede laboratorier skaber en yderst konkurrencedygtig og lovende ramme. Succesen af ​​den foreslåede forskning vil i høj grad afhænge af samarbejder. I løbet af de sidste fire år har jeg arbejdet meget inden for IPA blandt patienter med hæmato-onkologiske maligniteter, hvilket gjorde det muligt for mig at etablere de nødvendige kontakter og samarbejder, som er afgørende for projektets succes. Den største styrke ved denne multicenterundersøgelse er derfor samarbejdet med tre store centre for IPA-diagnose under ledelse af tre fremragende eksperter (Prof. Lass-Flörl, Prof. Buchheidt og Prof. Willinger), som har publiceret omfattende inden for IPA-diagnose over de seneste år/årtier. Jeg er sikker på, at vores resultater vil have vidtrækkende implementeringer for hele IPA-området. Det er klart, at de væsentligt vil fremme vores forståelse af den kliniske ydeevne af de nye point of care-applikationer.

Projektet forventes at få stor betydning for patientbehandlingen. Etablering af Lateral Flow Device-testen kan føre til hurtigt, ærligt talt på sengen, tilgængelige testresultater og kan derfor muliggøre tidligere påbegyndelse af passende antisvampebehandling, som kan hjælpe med at redde liv.

1. Baggrund

   Invasive svampeinfektioner (IFI) er en vigtig årsag til morbiditet og dødelighed blandt patienter med hæmato-onkologiske maligniteter (1-3). Invasive skimmelsvampeinfektioner (IMI), især invasiv aspergillose (IA), er den førende årsag til IFI blandt disse patienter, efterfulgt af invasive Candida-infektioner (2, 4). På grund af den rå dødelighed på 80-90 % i mangel af tilstrækkelig behandling, er rettidig diagnose og tidlig start af antifungal terapi nøglefaktorer i den vellykkede behandling af IFI. Forskellige undersøgelser har vist, at tidlig initiering af antifungal behandling kan forbedre IFI-overlevelsen til over 80 % (5, 6). Kliniske tegn og symptomer på IFI samt radiologiske fund er dog ofte uspecifikke. Manglende evne til konsekvent at stille en tidlig og overbevisende diagnose forbliver derfor et centralt problem. European Organisation for Research and Treatment of Cancer Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) og Mycoses Study Group fra National Institute of Allergy and Infectious Disease (MSG) havde en vis succes med at tackle dette problem ved at etablere konsensusdefinitioner for opportunistisk IFI (7 ). Definitioner i EORTC/MSG-retningslinjer var imidlertid ikke kun baseret på gennemgang af litteraturen, men også ekspertudtalelser og efterfølgende international konsensus. Hovedårsagen var, at undersøgelser, der vurderede detaljer i definitionerne, til dels ganske enkelt ikke var tilgængelige. I en nylig kohorteundersøgelse foreslog vores arbejdsgruppe nogle ændringer af kriterierne (8).

   Ved brug af EORTC/MSG-kriterier afhænger prævalensen af ​​IFI stærkt af mykologisk evidens, som ikke er let at få. Kultur-baserede diagnostiske tilgange kræver ikke kun invasive diagnostiske procedurer, som ofte hindres af den alvorlige medicinske tilstand hos patienter med risiko for IFI, men resulterer faktisk også ofte i falsk negative. Antigentestning med hurtigt tilgængelige testresultater er derfor blevet stadig vigtigere for at skabe et realistisk billede af byrden af ​​IFI og muliggøre tidlig diagnosticering og behandling hos patienter med IFI (1). Antigentest kan ikke kun lette tidlig diagnose, men kan også forhindre overbehandling, som er blevet hyppig. En nylig undersøgelse foretaget af Azoulay og kolleger, der evaluerede svampedræbende terapi på én dag på flere franske hospitaler, bekræftede, at de fleste af de patienter, der fik svampedræbende midler, faktisk ikke havde IFI (9). Overbehandling kan ikke kun øge omkostningerne betydeligt (daglige omkostninger for de fleste svampedræbende midler 600-1000 €), men kan også føre til udvikling af resistens (10). Brugen af ​​meget følsomme og specifikke hurtigt tilgængelige antigentests/biomarkører kan guide klinikeren til kun at påbegynde antifungal behandling hos patienter, der har gavn af behandlingen, da de virkelig har IFI. Sidst men ikke mindst kan antigentestning også være nyttig til tidlig responsvurdering, terapimonitorering og behandlingsstratificering, herunder beslutningen om, hvornår antifungal behandling skal stoppes hos patienter med IA (11-12).

   En af de største begrænsninger ved GM-testen er, at tiden til resultater varierer mellem centrene (mellem mindre end en dag og op til flere dage), hovedsageligt afhængigt af antallet af prøver, der testes rutinemæssigt (da testen udføres med plader, der dækker 96 tests), og afstanden/varigheden af ​​transporten mellem den kliniske indstilling og laboratoriet, hvor testen udføres. Disse begrænsninger overvindes af Lateral Flow Device Test, en point of care-test til IA udviklet af prof. Thornton fra University of Exeter, Storbritannien. Denne enkeltprøvetest kan nemt udføres i hvert laboratorium ved hjælp af BAL- og serumprøver, og tiden til resultatet er cirka 20 minutter. Nylige undersøgelser har vist testens enorme potentiale i humane BAL- og serumprøver (13-15). I en meget nylig undersøgelse evaluerede vores arbejdsgruppe retrospektivt LFD-testen ved at bruge bronchoalveolar lavage (BAL) prøver fra patienter med hæmatologiske maligniteter og patienter efter solid organtransplantation (SOT). 39 BAL-prøver fra 37 patienter blev inkluderet (29 prøver af hæmatologiske maligniteter og 10 prøver SOT; 12 sandsynlige IPA, 9 mulige IPA, 16 ingen IPA). Sensitiviteten og specificiteten af ​​BAL LFD-testen for sandsynlig IPA var henholdsvis 100 % og 81 %. GM-niveauer i tilfælde med negativ LFD var signifikant lavere end hos patienter med positiv LFD (P <0,0001). Vi konkluderede, at LFD-testen af ​​BAL-prøver udføres let og giver nøjagtige og hurtigt tilgængelige resultater. Derfor kan denne nye point-of-care-test være en meget lovende diagnostisk tilgang til påvisning af IPA i BAL-prøver fra hæmatologisk malignitet og SOT-patienter (16). En anden nylig undersøgelse viste i en neutropen marsvinmodel, at LFD-analysen er reproducerbar mellem forskellige laboratorier og undersøgelser (17). Multicenterundersøgelser er imidlertid nødvendige for yderligere at evaluere testen (16).

   I den foreslåede undersøgelse vil vi evaluere BAL Lateral Flow Device Test og sammenligne resultater med rutinemæssigt udførte Galactomannan-værdier samt kultur- og PCR-resultater.

2. Undersøgelsesdesign og metoder 2.1. Undersøgelsesdesign Undersøgelsesdesignet er undersøgende, retrospektivt og multicentrisk. Undersøgelsen starter i marts 2013 med en varighed på 13 måneder.

   2.2. Studiesteder

   1. Sektion for infektionssygdomme, Institut for Intern Medicin, Medical University of Graz, Østrig
   2. Afdeling for hygiejne og medicinsk mikrobiologi, Innsbruck Medical University, Østrig
   3. Afdeling for klinisk mikrobiologi, Medical University of Wien, Østrig
   4. Mannheim Universitetshospital, Universitetet i Heidelberg, Tyskland

   2.3. Undersøgelsespopulation Alle opbevarede eller rutinemæssigt opnåede BAL-prøver fra voksne patienter med risiko for invasiv pulmonal aspergillose vil være berettiget til undersøgelse. De behandlende klinikere vil blive blindet over for BAL Lateral Flow Device testresultater, og testen vil derfor ikke have nogen indflydelse på patientstyring/behandlingsbeslutninger. De behandlende klinikere vil blive blindet for BAL Lateral Flow Device-testresultater. Testresultater vil derfor ikke have nogen indflydelse på kliniske/behandlingsbeslutninger og derfor ikke påvirke de inkluderede patienter.

   Underliggende sygdomme, EORTC-status for IFI (begge tilgængelige fra den kliniske ordre, der ledsager BAL-prøven) og andre mikrobiologiske/mykologiske testresultater vil blive registreret i en elektronisk database. Der kræves ingen patientrelaterede personlige data.

   2.3.1 Nøglekriterier for inklusion

   1. Patienter over 18 år.
   2. BAL prøve opnået i klinisk rutine.

   3. I risiko for IFI (ifølge behandlende klinikere). Risikofaktorer kan omfatte:

      • febril neutropeni
      • induktionskemoterapi
      • allogen stamcelletransplantation/transplantat versus værtssygdom
      • kliniske/radiologiske/mykologiske fund mistænkelige for IFI
      • Solid Organ transplantation
      • ICU patient
      • Levercirrhose 2.3.2 Nøgle eksklusionskriterier
   1. Under 18 år.
   2. Ingen BAL-prøve opnået i klinisk rutine.

   d.) Ikke i fare for IFI.

   2.4. Lateral Flow Device-testning Den tidligere beskrevne lateral flow-enhed evalueres i BAL'er fra patienter med risiko for invasiv aspergillose. Kort fortalt immobiliseres et immunoglobulin G (IgG) monoklonalt antistof (JF5) mod en epitop på et ekstracellulært antigen, der udskilles konstitutivt under aktiv vækst af Aspergillus, til en indfangningszone på en porøs nitrocellulosemembran. JF5 IgG er også konjugeret til kolloide guldpartikler for at tjene som detektionsreagens. BAL-væske (100 μl ren prøve, uden forbehandling) tilsættes til en frigørelsespude indeholdende antistof-guld-konjugatet, som bandt målantigenet, og passerede derefter langs den porøse membran og bundet til JF5 IgG monoklonalt antistof immobiliseret i fangstzonen. Lateral Flow Device (LFD) Resultater aflæses 15 minutter efter indlæsning af prøven. Bundet antigen-antistof-guld-komplekser observeres som en rød linje (T for test) med en intensitet proportional med antigenkoncentrationen og blev klassificeret som negative, svagt positive, moderat positive eller stærkt positive (fig. 1). Anti-mus immunoglobulin immobiliseret til membranen i en separat zone (C for kontrol) tjener som en intern kontrol (13, 15). Detaljeret produktinformation kan findes i den vedhæftede publikation "Development of an Immunochromatography Lateral-Flow Device for Rapid Serodiagnosis of Invasive Aspergillose" (14).

   Da enheden er i færd med at blive CE-mærket til europæisk brug som medicinsk diagnostisk enhed, kan man kun se de aktuelle resultater som en multicenter prototype-testsammenligning (uden kliniske implikationer for patientbehandling).

3. Statistiske overvejelser Statistisk analyse inklusive multivariate analyser vil blive udført i samarbejde med bl.a. Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. tech. Josef Haas fra Institut for Medicinsk Informatik, Statistik og Dokumentation, Medical University of Graz og Univ. Doz. Mag. Dr. Herbert Schwetz, Universitetet i Salzburg.

3.1. Beregning af stikprøvestørrelse På grund af det eksplorative undersøgelsesdesign er statistisk stikprøvestørrelsesberegning ikke mulig. Prøvestørrelsen er blevet beregnet ved at bruge nyligt publicerede epidemiologiske data fra involverede centre (3, 16). Det foreslåede antal patienter, der skal undersøges, er repræsentativt og passende til at generere data til yderligere undersøgelser og er blevet anset for at være tilstrækkeligt af den statistiske rådgiver.

3.2. Statistisk analyse Statistisk analyse vil blive udført ved at bruge SPSS i samarbejde med vores specialiserede samarbejdspartnere nævnt ovenfor.

Referencer

1. Hoenigl M, Valentin T, Salzer HJ, Zollner-Schwetz I, Krause R. Undervurderer den reelle byrde af invasive svampeinfektioner hos hæmatopoietiske stamcelletransplanterede modtagere? Clin Infect Dis. 2010 Jul 15;51(2):253,4; forfatterens svar 254-5.
2. Kontoyiannis DP, Marr KA, Park BJ, Alexander BD, Anaissie EJ, Walsh TJ, et al. Prospektiv overvågning for invasive svampeinfektioner hos hæmatopoietiske stamcelletransplanterede modtagere, 2001-2006: Oversigt over databasen for transplantationsassocieret infektionsovervågningsnetværk (TRANSNET). Clin Infect Dis. 2010 apr 15;50(8):1091-100.
3. Hoenigl M, Salzer HJ, Raggam RB, Valentin T, Rohn A, Woelfler A, et al. Indvirkning af galactomannan-testning på forekomsten af ​​invasiv aspergillose hos patienter med hæmatologiske maligniteter. Med Mycol. 2012 Apr;50(3):266-9.
4. Perkhofer S, Lass-Florl C, Hell M, Russ G, Krause R, Honigl M, et al. Det landsdækkende østrigske aspergillus-register: En prospektiv dataindsamling om epidemiologi, terapi og udfald af invasive skimmelsvampeinfektioner hos immunkompromitterede og/eller immunsupprimerede patienter. Int J Antimikrobielle midler. 2010 Dec;36(6):531-6.
5. Greene RE, Schlamm HT, Oestmann JW, Stark P, Durand C, Lortholary O, et al. Billeddiagnostiske fund ved akut invasiv pulmonal aspergillose: Klinisk betydning af halotegnet. Clin Infect Dis. 1. februar 2007;44(3):373-9.
6. Lass-Florl C, Resch G, Nachbaur D, Mayr A, Gastl G, Auberger J, et al. Værdien af ​​computertomografi-guidet perkutan lungebiopsi til diagnose af invasiv svampeinfektion hos immunkompromitterede patienter. Clin Infect Dis. 2007 1. okt;45(7):e101-4.
7. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, Stevens DA, Edwards JE, Calandra T, et al. Reviderede definitioner af invasiv svampesygdom fra den europæiske organisation for forskning og behandling af kræft/invasive svampeinfektioner kooperativ gruppe og det nationale institut for allergi og infektionssygdomme mycoses studiegruppe (EORTC/MSG) konsensusgruppe. Clin Infect Dis. 2008 Jun 15;46(12):1813-21.
8. Hoenigl M, Strenger V, Buzina W, Valentin T, Koidl C, Wolfler A, et al. Europæisk organisation for forskning og behandling af Cancer/Mycoses studiegruppe (EORTC/MSG) værtsfaktorer og invasive svampeinfektioner hos patienter med hæmatologiske maligniteter. J Antimicrob Chemother. 7. maj 2012.
9. Azoulay E, Dupont H, Tabah A, Lortholary O, Stahl JP, Francais A, et al. Systemisk antifungal behandling hos kritisk syge patienter uden invasiv svampeinfektion*. Crit Care Med. 2012 Mar;40(3):813-22.
10. van der Linden JW, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJ, Mattsson E, Debets-Ossenkopp YJ, et al. Kliniske implikationer af azolresistens i aspergillus fumigatus, Holland, 2007-2009. Emerg Infect Dis. 2011 okt;17(10):1846-54.
11. Seeber K, Duettmann W, Krause R, Hoenigl M. Nytten af ​​serum galactomannan-assayet til tidlig responsvurdering og behandlingsstratifikationer af invasiv aspergillose. Curr Fungal Infect Rep [DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5]. 2012 Online First™, 29. juni 2012; DOI: 10.1007/s12281-012-0099-5.
12. Chamilos G, Luna M, Lewis RE, Bodey GP, Chemaly R, Tarrand JJ, et al. Invasive svampeinfektioner hos patienter med hæmatologiske maligniteter i et tertiært kræftcenter: En obduktionsundersøgelse over en 15-årig periode (1989-2003). Hæmatologica. 2006 jul;91(7):986-9.
13. Thornton C, Johnson G, Agrawal S. Påvisning af invasiv pulmonal aspergillose hos hæmatologiske maligne patienter ved hjælp af lateral flow-teknologi. J Vis Exp. 22. marts 2012;(61). pii: 3721. doi(61):10.3791/3721.
14. Thornton CR. Udvikling af en immunokromatografisk lateral flow-enhed til hurtig serodiagnose af invasiv aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2008 Jul;15(7):1095-105.
15. Wiederhold NP, Thornton CR, Najvar LK, Kirkpatrick WR, Bocanegra R, Patterson TF. Sammenligning af lateral flow teknologi og galactomannan og (1->3)-beta-D-glucan assays til påvisning af invasiv pulmonal aspergillose. Clin Vaccine Immunol. 2009 Dec;16(12):1844-6.
16. Hoenigl M, Koidl C, Duettmann W, Seeber K, Wagner J, Buzina W, et al. Bronchoalveolar lavage lateral-flow device test til invasiv pulmonal aspergillose diagnose hos hæmatologisk malignitet og solid organtransplantation patienter. J Infect. 2012;65(6):588-91.
17. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra R, Kirkpatrick WR, Patterson TF, Thornton CR. Reproducerbarhed mellem laboratorier og undersøgelser af en ny lateral-flow-anordning og indflydelsen af ​​svampedræbende terapi på påvisningen af ​​invasiv lunge aspergillose. J Clin Microbiol. 2013; epup før tryk