Produkce cytokinů v tkáni tlustého střeva u pacientů s IBD

Název projektu:

Účinnost kanabinoidů při léčbě zánětlivého onemocnění střev

Otázka k prošetření:

Rostlina marihuany, Cannabis sativa, se používá jako lék na různé nemoci. Bylo hlášeno, že kanabinoidy zmírňují neurologické stavy včetně symptomů souvisejících s RS, jako je spasticita, bolest, třes a dysfunkce močového měchýře. Jiné neurologické stavy, jako je chronická neovladatelná bolest, dystonické pohybové poruchy a Tourettův syndrom, byly také hlášeny jako zmírněné užíváním konopí. Konopí se používá k léčbě anorexie u pacientů s AIDS a rakovinou. V gastroenterologii se konopí používá k léčbě anorexie, zvracení, bolesti břicha, gastroenteritidy, průjmu, střevních zánětů a diabetické gastroparézy.

Rostlina konopí obsahuje více než 60 různých sloučenin, které jsou souhrnně označovány jako kanabinoidy. Z nich dvě sloučeniny delta 9-tetrahydrokanabinol (THC) a kanabidiol (CBD) se zdají být nejaktivnější.

Kanabinoidy mají hluboký protizánětlivý účinek, zejména prostřednictvím receptoru CB2. Bylo zjištěno, že u chronických uživatelů marihuany je narušena imunita zprostředkovaná buňkami. U hlodavců byl pozorován silný protizánětlivý účinek konopí. Studium funkčních rolí endokanabinoidního systému v imunitní modulaci ukazuje, že se účastní téměř všech hlavních imunitních událostí. Kanabinoidy posouvají rovnováhu prozánětlivých cytokinů a protizánětlivých cytokinů směrem k profilům T-helper buněk typu 2 (fenotyp Th2) a potlačují buněčně zprostředkovanou imunitu, zatímco humorální imunita může být posílena. Bylo prokázáno, že kanabidiol snižuje zánět u myšího modelu revmatoidní artritidy a diabetes mellitus I. typu.

Proto lze kanabinoidy použít k léčbě různých zánětlivých stavů včetně revmatoidní artritidy a astmatu.

Ve střevě jsou endokanabinoidy produkovány jak serózní, tak slizniční složkou lidského střeva a studie na buněčných liniích ukázaly, že lidské střevní epiteliální buňky mohou produkovat endokanabinoidy; další zdroje endokanabinoidů ve střevě zahrnují lidské endoteliální buňky, krevní destičky, rezidentní makrofágy a další imunitní buňky, jako jsou lymfocyty. CB1 a CB2 receptory jsou upregulovány v experimentálních modelech zánětlivého onemocnění střev. U myšího modelu kolitidy bylo zjištěno, že kanabinoidy zmírňují zánět a v lidském střevě se během zánětu zvyšují hladiny anandamidu. Zanícené tenké střevo má také významně zvýšenou aktivitu FAAH a také expresi kanabinoidních receptorů CB1.

Přesné buněčné cíle zapojené do snižování zánětu kanabinoidy nejsou známy. V modelu bronchopulmonálního zánětu u myší podávání anandamidu snížilo hladiny TNF alfa v tekutině z bronchoalveolární laváže. Delta 9-tetrahydrokanabinol (THC) inhibuje syntézu IL-12, IL-2, IL-6, INF gama a proliferaci T buněk.

Mnoho pacientů s IBD uvádí, že kouření marihuany zmírnilo jejich příznaky, ale neexistují žádné klinické studie, které by toto pozorování zkoumaly. Nedávno jsme zveřejnili první hlášené pozorování užívání léčebného konopí u Crohnovy choroby. V naší studii se z 30 pacientů po léčbě konopím významně zlepšilo 21 pacientů. Průměrný index Harvey Bradshaw se zlepšil ze 14 ± 6,7 na 7 ± 4,7 (P < 0,001). Počet pohybů střev se snížil z průměrných osmi na pět denně a výrazně se snížila potřeba dalších léků, zejména steroidů. S ohledem na tyto výsledky jsme provedli dvojitě zaslepenou placebem kontrolovanou studii u 20 pacientů s aktivní Crohnovou chorobou. Pacienti s indexem aktivity Crohnovy choroby (CDAI) > 200, kteří nereagovali na steroidy, imunosupresiva nebo anti-TNF, byli randomizováni k užívání 2 cigaret konopí nebo placeba denně. Každá cigareta obsahovala 0,5 g konopí, což odpovídá 11,5 mg tetrahydrokanabinolu (THC). Placebo obsahovalo listy konopí, ze kterých bylo extrahováno THC. Během léčby se CDAI změnila ve skupině s konopím z 358 ± 99 na 139 ± 111 (p < 0,05) a ve skupině s placebem z 373 ± 94 na 306 ± 143 (p = nevýznamné). Pět pacientů ve skupině s konopím a jeden ve skupině s placebem přešlo do kompletní remise (CDAI <100). Tři pacienti závislí na steroidech ve skupině s konopím přestali užívat steroidy během studie. Pacienti hlásili zlepšení chuti k jídlu a spánku bez závažných vedlejších účinků.

Tyto předběžné údaje naznačují, že kanabinoidy mají velký potenciál v léčbě Crohnovy choroby, ale je zjevně zapotřebí další zkoumání jejich vlivu, způsobu účinku, aktivních a neaktivních kanabinoidů a alternativních cest aplikace. Nejdůležitější je otázka, zda zlepšení pozorované při konzumaci konopí je pouze symptomatické, nebo zda došlo ke skutečnému zlepšení zánětu.

Cílem navrhované studie je zhodnotit zánět a hladiny cytokinů v explantátech tlustého střeva pacientů s IBD s kanabidiolem a bez něj.

Materiály a metody:

Populace ve studii: Pacienti s Crohnovou chorobou nebo ulcerózní kolitidou plánovaní na kolonoskopii, jak to jejich lékař považuje za nutné, budou způsobilí pro studii. Po získání informovaného souhlasu budou odebrány biopsie ze zanícené a normální tkáně a zpracovány v médiu pro tkáňové kultury, jak je popsáno dále. Z každého místa bude provedeno 6 biopsií.

Metody:

Explantáty budou kultivovány ve skupinách po třech s povrchem klků nahoru na mikroporézních membránách (velikost pórů 0,45-_m) obsažených ve vložkách pro tkáňové kultury Millicell-HA (Millipore). Vložky budou umístěny do 6-jamkových plastových misek pro tkáňové kultury (Costar 3506) spolu s 1,5 ml média pro tkáňové kultury. Tkáňové kultivační médium bude Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium doplněné 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem, penicilinem (100 jednotek/ml), streptomycinem (100 μg/ml), leupeptinem (50 μg/ml), PMSF (1 mM), sójou inhibitor trypsinu (50 μg/ml) a dexamethason (200 μg/ml). Kultury budou inkubovány při teplotě 37 °C v inkubátoru a každou hodinu probublány 95% kyslíkem a 5% oxidem uhličitým. Z každého místa bude získáno šest biopsií. Tři biopsie budou sloužit jako kontrola a tři budou kultivovány s přídavkem kanabidiolu (1 μg/ml). Po 24 hodinách bude životaschopnost tkáně hodnocena přidáním Alamaru k jednomu z každých 3 vzorků. Změna barvy z fialové na růžovou indikuje životaschopnou tkáň. Supernatant z dalších 4 biopsií bude odebrán a zmražen při -20 °C. Biopsie budou poté umístěny do formalínu pro patologickou kontrolu.

Supernatant z kontrolovaných vzorků a vzorků ošetřených konopím bude analyzován na přítomnost a hladinu TNF alfa, interferonu gama, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 a IL-6.