Produzione di citochine di tessuto del colon da pazienti affetti da IBD

Titolo del progetto:

Efficacia dei cannabinoidi nel trattamento della malattia infiammatoria intestinale

Domanda da indagare:

La pianta di marijuana, Cannabis sativa, è stata utilizzata come trattamento medicinale per una varietà di malattie. È stato riportato che i cannabinoidi alleviano le condizioni neurologiche, inclusi i sintomi correlati alla SM come spasticità, dolore, tremore e disfunzione della vescica. È stato riportato che anche altre condizioni neurologiche, come il dolore cronico intrattabile, i disturbi del movimento distonico e la sindrome di Tourette sono alleviate dall'uso di cannabis. La cannabis è stata usata per trattare l'anoressia nei malati di AIDS e di cancro. In gastroenterologia, la cannabis è stata utilizzata per trattare l'anoressia, il vomito, il dolore addominale, la gastroenterite, la diarrea, l'infiammazione intestinale e la gastroparesi diabetica.

La pianta di cannabis contiene oltre 60 composti diversi che vengono collettivamente indicati come cannabinoidi. Di questi, i due composti delta 9-tetraidrocannabinolo (THC) e Cannabidiolo (CBD) sembrano essere i più attivi.

I cannabinoidi hanno un profondo effetto antinfiammatorio, principalmente attraverso il recettore CB2. L'immunità cellulo-mediata è risultata compromessa nei consumatori cronici di marijuana. Nei roditori è stato osservato un potente effetto antinfiammatorio della cannabis. Lo studio dei ruoli funzionali del sistema endocannabinoide nella modulazione immunitaria rivela che è coinvolto in quasi tutti i principali eventi immunitari. I cannabinoidi spostano l'equilibrio delle citochine pro-infiammatorie e delle citochine antinfiammatorie verso i profili delle cellule T-helper di tipo 2 (fenotipo Th2) e sopprimono l'immunità cellulo-mediata, mentre l'immunità umorale può essere potenziata. È stato dimostrato che il cannabidiolo riduce l'infiammazione in un modello murino di artrite reumatoide e diabete mellito di tipo I.

Pertanto, i cannabinoidi possono essere usati per trattare varie condizioni infiammatorie tra cui l'artrite reumatoide e l'asma.

Nell'intestino, gli endocannabinoidi sono prodotti sia dalla componente sierosa che da quella mucosa dell'intestino umano e studi su linee cellulari hanno dimostrato che le cellule epiteliali intestinali umane possono produrre endocannabinoidi; ulteriori fonti di endocannabinoidi nell'intestino includono cellule endoteliali umane, piastrine, macrofagi residenti e altre cellule immunitarie come i linfociti. I recettori CB1 e CB2 sono sovraregolati in modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale. In un modello murino di colite, è stato scoperto che i cannabinoidi migliorano l'infiammazione e nell'intestino umano i livelli di anandamide aumentano durante l'infiammazione. L'intestino tenue infiammato ha anche un'attività significativamente elevata di FAAH così come l'espressione dei recettori dei cannabinoidi CB1.

Gli esatti bersagli cellulari implicati nella riduzione dell'infiammazione da parte dei cannabinoidi sono sconosciuti. In un modello di infiammazione broncopolmonare nei topi, la somministrazione di anandamide ha ridotto i livelli di TNF alfa nel liquido di lavaggio broncoalveolare. Il delta 9-tetraidrocannabinolo (THC) inibisce la sintesi di IL-12, IL-2, IL-6, INF gamma e la proliferazione delle cellule T.

Molti pazienti con IBD riferiscono che il fumo di marijuana ha migliorato i loro sintomi, ma non ci sono studi clinici che indagano su questa osservazione. Abbiamo recentemente pubblicato la prima osservazione segnalata sull'uso di cannabis terapeutica nella malattia di Crohn. Nel nostro studio, su 30 pazienti, 21 sono migliorati significativamente dopo il trattamento con cannabis. L'indice medio di Harvey Bradshaw è migliorato da 14 ± 6,7 a 7 ± 4,7 (P <0,001). Il numero di movimenti intestinali è stato ridotto da una media di otto al giorno a cinque al giorno e la necessità di altri farmaci, in particolare gli steroidi, è stata significativamente ridotta. Alla luce di questi risultati, abbiamo condotto uno studio in doppio cieco controllato con placebo su 20 pazienti con malattia di Crohn attiva. I pazienti con un indice di attività della malattia di Crohn (CDAI)>200 che non rispondevano a steroidi, immunosoppressori o anti-TNF sono stati randomizzati a ricevere 2 sigarette di cannabis o placebo al giorno. Ogni sigaretta conteneva 0,5 g di cannabis, corrispondenti a 11,5 mg di tetraidrocannabinolo (THC). Il placebo conteneva foglie di cannabis da cui veniva estratto il THC. Durante il trattamento il CDAI è cambiato nel gruppo cannabis da 358 ± 99 a 139±111 (p<0.05) e nel gruppo placebo da 373 ± 94 a 306±143 (p=Non significativo). Cinque pazienti nel gruppo cannabis e uno nel gruppo placebo sono andati in remissione completa (CDAI <100). Tre pazienti dipendenti da steroidi nel gruppo della cannabis hanno interrotto gli steroidi durante lo studio. I pazienti hanno riportato un miglioramento dell'appetito e del sonno, senza gravi effetti collaterali.

Questi dati preliminari indicano che i cannabinoidi hanno un grande potenziale nel trattamento del morbo di Crohn, ma sono chiaramente necessarie ulteriori indagini sulla loro influenza, modalità di azione, cannabinoidi attivi e non attivi e vie alternative di applicazione. La cosa più importante è la questione se il miglioramento osservato con il consumo di cannabis sia solo sintomatico o se vi sia un reale miglioramento dell'infiammazione.

Lo scopo dello studio proposto è valutare i livelli di infiammazione e citochine in espianti di tessuto del colon da pazienti con IBD con e senza cannabidiolo.

Materiali e metodi:

Popolazione in studio: I pazienti con morbo di Crohn o colite ulcerosa in attesa di colonscopia come ritenuto necessario dal loro medico saranno eleggibili per lo studio. Dopo aver ottenuto il consenso informato, le biopsie da tessuto infiammato e normale verranno prelevate e processate in un terreno di coltura tissutale come descritto di seguito. Ci saranno 6 biopsie da ogni sito.

Metodi:

Gli espianti saranno coltivati ​​in gruppi di tre con i villi che affiorano su membrane microporose (dimensione dei pori 0.45-_m) contenute in inserti di coltura tissutale Millicell-HA (Millipore). Gli inserti verranno posizionati all'interno di piastre di coltura tissutale in plastica a 6 pozzetti (Costar 3506) insieme a 1,5 ml di terreno di coltura tissutale. Il mezzo di coltura tissutale sarà il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero di vitello fetale inattivato al calore, penicillina (100 unità/ml), streptomicina (100 μg/ml), leupeptina (50 μg/ml), PMSF (1 mM), soia inibitore della tripsina (50 μg/ml) e desametasone (200 μg/ml). Le colture saranno incubate a 37°C e gassate ogni ora con 95% ossigeno 5% anidride carbonica. Verranno ottenute sei biopsie da ciascun sito. Tre biopsie serviranno da controllo e tre saranno coltivate con l'aggiunta di Cannabidiolo (1 μg/ml). Dopo 24 ore la vitalità tissutale sarà valutata mediante l'aggiunta di Alamar a uno ogni 3 campioni. Il cambiamento di colore dal viola al rosa indica tessuto vitale. Il supernatante delle altre 4 biopsie sarà raccolto e congelato a -20°C. Le biopsie verranno quindi poste in formalina per l'ispezione patologica.

Il surnatante da campioni controllati e trattati con cannabis sarà analizzato per la presenza e il livello di TNF alfa, interferone gamma, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 e IL-6.