Produkcja cytokin w tkance okrężnicy od pacjentów z IBD

Tytuł projektu:

Skuteczność kannabinoidów w leczeniu nieswoistych zapaleń jelit

Pytanie do zbadania:

Roślina marihuany, Cannabis sativa, była stosowana w leczeniu różnych chorób. Donoszono, że kannabinoidy łagodzą stany neurologiczne, w tym objawy związane ze stwardnieniem rozsianym, takie jak spastyczność, ból, drżenie i dysfunkcja pęcherza moczowego. Zgłaszano, że inne stany neurologiczne, takie jak przewlekły trudny do leczenia ból, dystoniczne zaburzenia ruchowe i zespół Tourette'a, zostały złagodzone przez używanie konopi indyjskich. Konopie indyjskie były stosowane w leczeniu anoreksji u pacjentów z AIDS i rakiem. W gastroenterologii marihuana była stosowana w leczeniu anoreksji, wymiotów, bólu brzucha, zapalenia żołądka i jelit, biegunki, zapalenia jelit i gastroparezy cukrzycowej.

Roślina konopi zawiera ponad 60 różnych związków, które wspólnie określa się jako kannabinoidy. Spośród nich dwa związki delta 9-tetrahydrokannabinol (THC) i kannabidiol (CBD) wydają się być najbardziej aktywne.

Kannabinoidy mają głębokie działanie przeciwzapalne, głównie poprzez receptor CB2. Stwierdzono, że odporność komórkowa jest osłabiona u przewlekle używających marihuany. U gryzoni zaobserwowano silne przeciwzapalne działanie konopi indyjskich. Badanie funkcjonalnych ról układu endokannabinoidowego w modulacji odporności ujawnia, że ​​bierze on udział w prawie wszystkich głównych zdarzeniach immunologicznych. Kannabinoidy przesuwają równowagę cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych w kierunku profili komórek pomocniczych T typu 2 (fenotyp Th2) i tłumią odporność komórkową, podczas gdy odporność humoralna może zostać zwiększona. Wykazano, że kannabidiol zmniejsza stan zapalny w mysim modelu reumatoidalnego zapalenia stawów i cukrzycy typu I.

Dlatego kannabinoidy mogą być stosowane w leczeniu różnych stanów zapalnych, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów i astmy.

W jelitach endokannabinoidy są wytwarzane zarówno przez błonę surowiczą, jak i błonę śluzową ludzkiego jelita, a badania na liniach komórkowych wykazały, że ludzkie komórki nabłonkowe jelit mogą wytwarzać endokannabinoidy; dodatkowe źródła endokannabinoidów w jelitach obejmują ludzkie komórki śródbłonka, płytki krwi, rezydujące makrofagi i inne komórki odpornościowe, takie jak limfocyty. Receptory CB1 i CB2 są regulowane w górę w eksperymentalnych modelach nieswoistego zapalenia jelit. W mysim modelu zapalenia jelita grubego stwierdzono, że kannabinoidy łagodzą stany zapalne, aw jelicie ludzkim poziom anandamidu wzrasta podczas stanu zapalnego. Zapalone jelito cienkie ma również znacznie podwyższoną aktywność FAAH oraz ekspresję receptorów kannabinoidowych CB1.

Dokładne cele komórkowe związane z redukcją stanu zapalnego przez kannabinoidy są nieznane. W modelu zapalenia oskrzelowo-płucnego u myszy podawanie anandamidu obniżyło poziomy TNF alfa w płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych. Delta 9-tetrahydrokannabinol (THC) hamuje syntezę IL-12, IL-2, IL-6, INF gamma i proliferację komórek T.

Wielu pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit twierdzi, że palenie marihuany złagodziło ich objawy, ale nie ma badań klinicznych potwierdzających tę obserwację. Niedawno opublikowaliśmy pierwszą zgłoszoną obserwację stosowania medycznej marihuany w chorobie Leśniowskiego-Crohna. W naszym badaniu, spośród 30 pacjentów, u 21 nastąpiła znaczna poprawa po leczeniu konopiami indyjskimi. Średni wskaźnik Harveya Bradshawa poprawił się z 14 ± 6,7 do 7 ± 4,7 (p < 0,001). Liczba wypróżnień została zmniejszona ze średnio ośmiu do pięciu dziennie, a zapotrzebowanie na inne leki, zwłaszcza sterydy, zostało znacznie zmniejszone. W świetle tych wyników przeprowadziliśmy podwójnie ślepą próbę z grupą kontrolną otrzymującą placebo u 20 pacjentów z czynną chorobą Leśniowskiego-Crohna. Pacjenci ze wskaźnikiem aktywności choroby Leśniowskiego-Crohna (CDAI) >200, którzy nie reagowali na sterydy, leki immunosupresyjne lub anty-TNF, zostali losowo przydzieleni do otrzymywania 2 papierosów z konopi indyjskich lub placebo dziennie. Każdy papieros zawierał 0,5 g marihuany, co odpowiadało 11,5 mg tetrahydrokanabinolu (THC). Placebo zawierało liście konopi, z których wyekstrahowano THC. Podczas leczenia CDAI zmieniło się w grupie konopi indyjskich z 358 ± 99 do 139 ± 111 (p <0,05), aw grupie placebo z 373 ± 94 do 306 ± 143 (p = nieistotne). Pięciu pacjentów z grupy konopi indyjskich i jeden z grupy placebo osiągnęło całkowitą remisję (CDAI <100). Trzech pacjentów zależnych od sterydów z grupy konopi indyjskich zaprzestało przyjmowania sterydów podczas badania. Pacjenci zgłaszali poprawę apetytu i snu, bez poważnych skutków ubocznych.

Te wstępne dane wskazują, że kannabinoidy mają ogromny potencjał w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna, ale zdecydowanie potrzebne są dalsze badania ich wpływu, sposobu działania, aktywnych i nieaktywnych kannabinoidów oraz alternatywnych dróg stosowania. Najważniejsze jest pytanie, czy poprawa obserwowana po spożyciu konopi indyjskich jest tylko objawowa, czy też istnieje rzeczywista poprawa stanu zapalnego.

Celem proponowanego badania jest ocena stanu zapalnego i poziomu cytokin w eksplantatach tkanki okrężnicy od pacjentów z IBD z kannabidiolem i bez niego.

Materiały i metody:

Populacja badana: Pacjenci z chorobą Leśniowskiego-Crohna lub wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego zakwalifikowani do kolonoskopii, jeśli ich lekarz uzna to za konieczne, będą kwalifikować się do badania. Po uzyskaniu świadomej zgody biopsje z tkanki objętej stanem zapalnym i zdrowej zostaną pobrane i przetworzone w pożywce do hodowli tkankowej zgodnie z dalszym opisem. Z każdego miejsca zostanie pobranych 6 biopsji.

Metody:

Eksplantaty będą hodowane w grupach po trzy z kosmkami skierowanymi ku górze na mikroporowatych membranach (wielkość porów 0,45-μm) zawartych we wkładkach do hodowli tkankowych Millicell-HA (Millipore). Wkładki zostaną umieszczone w 6-dołkowych plastikowych naczyniach do hodowli tkankowych (Costar 3506) wraz z 1,5 ml pożywki do hodowli tkankowych. Pożywką do hodowli tkankowych będzie pożywka Dulbecco zmodyfikowana przez Dulbecco, uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą, penicyliną (100 jednostek/ml), streptomycyną (100 μg/ml), leupeptyną (50 μg/ml), PMSF (1 mM), soją inhibitor trypsyny (50 μg/ml) i deksametazon (200 μg/ml). Hodowle będą inkubowane w inkubatorze o temperaturze 37°C i gazowane co godzinę 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Uzyskanych zostanie sześć biopsji z każdego miejsca. Trzy biopsje będą służyć jako kontrola, a trzy będą hodowane z dodatkiem kannabidiolu (1 μg/ml). Po 24 godzinach żywotność tkanki zostanie oceniona przez dodanie Alamar do jednej z każdych 3 próbek. Zmiana koloru z fioletowego na różowy wskazuje na żywą tkankę. Supernatant z pozostałych 4 biopsji zostanie zebrany i zamrożony w temperaturze -20°C. Biopsje zostaną następnie umieszczone w formalinie do kontroli patologicznej.

Supernatant z próbek kontrolowanych i traktowanych konopiami będzie analizowany pod kątem obecności i poziomu TNF alfa, interferonu gamma, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 i IL-6.