Cytokine-productie van colonweefsel van IBD-patiënten

Titel van het project:

Werkzaamheid van cannabinoïden bij de behandeling van inflammatoire darmaandoeningen

Te onderzoeken vraag:

De marihuanaplant, Cannabis sativa, wordt gebruikt als medicinale behandeling voor verschillende ziekten. Van cannabinoïden is gemeld dat ze neurologische aandoeningen verlichten, waaronder MS-gerelateerde symptomen zoals spasticiteit, pijn, tremor en blaasdisfunctie. Van andere neurologische aandoeningen, zoals chronische hardnekkige pijn, dystonische bewegingsstoornissen en het syndroom van Gilles de la Tourette, werd ook gemeld dat ze door cannabisgebruik werden verlicht. Cannabis is gebruikt om anorexia te behandelen bij aids- en kankerpatiënten. In de gastro-enterologie is cannabis gebruikt voor de behandeling van anorexia, braken, buikpijn, gastro-enteritis, diarree, darmontsteking en diabetische gastroparese.

De cannabisplant bevat meer dan 60 verschillende verbindingen die gezamenlijk cannabinoïden worden genoemd. Hiervan lijken de twee verbindingen delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) en Cannabidiol (CBD) het meest actief.

Cannabinoïden hebben een sterk ontstekingsremmend effect, voornamelijk via de CB2-receptor. Celgemedieerde immuniteit bleek verzwakt te zijn bij chronische marihuanagebruikers. Bij knaagdieren werd een krachtig ontstekingsremmend effect van cannabis waargenomen. Bestudering van de functionele rol van het endocannabinoïdesysteem bij immuunmodulatie onthult dat het betrokken is bij bijna alle belangrijke immuungebeurtenissen. Cannabinoïden verschuiven de balans van ontstekingsbevorderende cytokines en ontstekingsremmende cytokines naar de T-helpercel type 2-profielen (Th2-fenotype) en onderdrukken celgemedieerde immuniteit, terwijl humorale immuniteit kan worden versterkt. Cannabidiol bleek ontstekingen te verminderen in een muismodel van reumatoïde artritis en diabetes mellitus type I.

Daarom kunnen cannabinoïden worden gebruikt om verschillende ontstekingsaandoeningen te behandelen, waaronder reumatoïde artritis en astma.

In de darm worden endocannabinoïden geproduceerd door zowel de serosale als de mucosale component van de menselijke darm, en studies met cellijnen hebben aangetoond dat menselijke darmepitheelcellen endocannabinoïden kunnen produceren; Andere bronnen van endocannabinoïden in de darmen zijn menselijke endotheelcellen, bloedplaatjes, interne macrofagen en andere immuuncellen zoals lymfocyten. CB1- en CB2-receptoren worden opgereguleerd in experimentele modellen van inflammatoire darmaandoeningen. In een muismodel van colitis bleken cannabinoïden ontstekingen te verlichten, en in de menselijke darm zijn de niveaus van anandamide verhoogd tijdens ontsteking. De ontstoken dunne darm heeft ook een significant verhoogde activiteit van FAAH en expressie van CB1-cannabinoïde-receptoren.

De exacte cellulaire doelwitten die betrokken zijn bij de vermindering van ontstekingen door cannabinoïden zijn onbekend. In een model van bronchopulmonale ontsteking bij muizen verlaagde de toediening van anandamide de TNF-alfaspiegels in bronchoalveolaire lavagevloeistof. Delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) remt de synthese van IL-12, IL-2, IL-6, INF-gamma en T-celproliferatie.

Veel patiënten met IBD melden dat het roken van marihuana hun symptomen verlichtte, maar er zijn geen klinische onderzoeken die deze observatie onderzoeken. We hebben onlangs de eerste gerapporteerde observatie van het gebruik van medicinale cannabis bij de ziekte van Crohn gepubliceerd. In ons onderzoek verbeterden 21 van 30 patiënten aanzienlijk na behandeling met cannabis. De gemiddelde Harvey Bradshaw-index verbeterde van 14 ± 6,7 naar 7 ± 4,7 (P < 0,001). Het aantal stoelgangen werd teruggebracht van gemiddeld acht per dag naar vijf per dag en de behoefte aan andere medicijnen, met name steroïden, werd aanzienlijk verminderd. Met het oog op die resultaten hebben we een dubbelblinde, placebogecontroleerde studie uitgevoerd bij 20 actieve patiënten met de ziekte van Crohn. Patiënten met een Crohn's Disease Activity Index (CDAI)>200 die niet reageerden op steroïden, immunosuppressiva of anti-TNF werden gerandomiseerd om dagelijks 2 sigaretten cannabis of placebo te krijgen. Elke sigaret bevatte 0,5 g cannabis, wat overeenkomt met 11,5 mg tetrahydrocannabinol (THC). De placebo bevatte cannabisbladeren waaruit THC werd gewonnen. Tijdens de behandeling veranderde de CDAI in de cannabisgroep van 358 ± 99 naar 139±111 (p<0,05) en in de placebogroep van 373 ± 94 naar 306±143 (p=Niet significant). Vijf patiënten in de cannabisgroep en één in de placebogroep gingen in volledige remissie (CDAI <100). Drie steroïdafhankelijke patiënten in de cannabisgroep stopten tijdens het onderzoek met steroïden. Patiënten meldden verbeterde eetlust en slaap, zonder ernstige bijwerkingen.

Deze voorlopige gegevens geven aan dat cannabinoïden een groot potentieel hebben bij de behandeling van de ziekte van Crohn, maar verder onderzoek naar hun invloed, werkingswijze, actieve en niet-actieve cannabinoïden en alternatieve toepassingsroutes is duidelijk nodig. Het belangrijkste is de vraag of de waargenomen verbetering bij cannabisgebruik alleen symptomatisch is of dat er een echte verbetering is in de ontsteking.

Het doel van de voorgestelde studie is het evalueren van ontstekingen en cytokineniveaus in explantaten van colonweefsel van IBD-patiënten met en zonder cannabidiol.

Materialen en methodes:

Onderzoekspopulatie: Patiënten met de ziekte van Crohn of colitis ulcerosa die gepland zijn voor colonoscopie, zoals noodzakelijk geacht door hun arts, komen in aanmerking voor het onderzoek. Na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming, zullen biopsieën van ontstoken en normaal weefsel worden genomen en verwerkt in een weefselkweekmedium zoals verder beschreven. Er zullen 6 biopsieën van elke site zijn.

methoden:

Explantaten zullen worden gekweekt in groepen van drie met het villus-oppervlak naar boven op microporeuze membranen (0,45-_m poriegrootte) die zich bevinden in Millicell-HA weefselkweekinserts (Millipore). De inzetstukken worden samen met 1,5 ml weefselkweekmedium in plastic weefselkweekschalen met 6 putjes (Costar 3506) geplaatst. Weefselkweekmedium zal Dulbecco's gemodificeerd Eagle's-medium zijn, aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum, penicilline (100 eenheden/ml), streptomycine (100 μg/ml), leupeptine (50 μg/ml), PMSF (1 mM), sojabonen trypsineremmer (50 μg/ml) en dexamethason (200 μg/ml). Kweken worden geïncubeerd bij 37°C incubator en elk uur begast met 95% zuurstof 5% kooldioxide. Er zullen zes biopsieën van elke site worden verkregen. Drie biopsieën dienen als controle en drie worden gekweekt met toevoeging van Cannabidiol (1 μg/ml). Na 24 uur wordt de levensvatbaarheid van het weefsel beoordeeld door toevoeging van Alamar aan een van elke 3 monsters. Verandering van kleur van paars naar roze duidt op levensvatbaar weefsel. Het supernatant van de andere 4 biopten wordt verzameld en ingevroren bij -20°C. De biopten worden dan in formaline geplaatst voor pathologisch onderzoek.

Het supernatant van gecontroleerde en met cannabis behandelde monsters zal worden geanalyseerd op de aanwezigheid en het niveau van TNF-alfa, Interferon-gamma, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 en IL-6.