Produção de citocinas de tecido colônico de pacientes com DII

Título do projeto:

Eficácia dos canabinóides no tratamento da doença inflamatória intestinal

Questão a ser investigada:

A planta da maconha, Cannabis sativa, tem sido usada como tratamento medicinal para uma variedade de doenças. Foi relatado que os canabinóides aliviam condições neurológicas, incluindo sintomas relacionados à EM, como espasticidade, dor, tremor e disfunção da bexiga. Outras condições neurológicas, como dor crônica intratável, distúrbios do movimento distônico e síndrome de Tourette também foram relatadas como aliviadas pelo uso de cannabis. A cannabis tem sido usada para tratar a anorexia em pacientes com AIDS e câncer. Em gastroenterologia, a cannabis tem sido usada para tratar anorexia, êmese, dor abdominal, gastroenterite, diarreia, inflamação intestinal e gastroparesia diabética.

A planta de cannabis contém mais de 60 compostos diferentes que são referidos coletivamente como canabinóides. Destes, os dois compostos delta 9-tetraidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD) parecem ser os mais ativos.

Os canabinóides têm um profundo efeito anti-inflamatório, principalmente através do receptor CB2. A imunidade mediada por células foi encontrada prejudicada em usuários crônicos de maconha. Um potente efeito anti-inflamatório da cannabis foi observado em roedores. Estudar os papéis funcionais do sistema endocanabinóide na modulação imune revela que ele está envolvido em quase todos os principais eventos imunológicos. Os canabinóides alteram o equilíbrio de citocinas pró-inflamatórias e citocinas anti-inflamatórias para os perfis de células T auxiliares tipo 2 (fenótipo Th2) e suprimem a imunidade mediada por células, enquanto a imunidade humoral pode ser aumentada. O canabidiol demonstrou reduzir a inflamação em um modelo de camundongo com artrite reumatóide e diabetes mellitus tipo I.

Portanto, os canabinóides podem ser usados ​​para tratar várias condições inflamatórias, incluindo artrite reumatóide e asma.

No intestino, os endocanabinóides são produzidos tanto pelo componente seroso quanto pela mucosa do intestino humano, e estudos em linhas celulares mostraram que as células epiteliais intestinais humanas podem produzir endocanabinóides; fontes adicionais de endocanabinóides no intestino incluem células endoteliais humanas, plaquetas, macrófagos residentes e outras células imunes, como linfócitos. Os receptores CB1 e CB2 são regulados positivamente em modelos experimentais de doença inflamatória intestinal. Em um modelo de colite em camundongos, descobriu-se que os canabinóides melhoram a inflamação e, no intestino humano, os níveis de anandamida aumentam durante a inflamação. O intestino delgado inflamado também tem atividade significativamente elevada de FAAH, bem como expressão de receptores canabinóides CB1.

Os alvos celulares exatos implicados na redução da inflamação pelos canabinóides são desconhecidos. Em um modelo de inflamação broncopulmonar em camundongos, a administração de anandamida diminuiu os níveis de TNF alfa no líquido de lavagem broncoalveolar. Delta 9-tetraidrocanabinol (THC) inibe a síntese de IL-12, IL-2, IL-6, INF gama e proliferação de células T.

Muitos pacientes com DII relatam que fumar maconha melhorou seus sintomas, mas não há estudos clínicos investigando essa observação. Publicamos recentemente a primeira observação relatada do uso de cannabis medicinal na doença de Crohn. Em nosso estudo, de 30 pacientes, 21 melhoraram significativamente após o tratamento com cannabis. O índice médio de Harvey Bradshaw melhorou de 14 ± 6,7 para 7 ± 4,7 (P < 0,001). O número de evacuações foi reduzido de uma média de oito para cinco por dia e a necessidade de outros medicamentos, principalmente esteróides, foi significativamente reduzida. Em vista desses resultados, realizamos um estudo duplo-cego controlado por placebo em 20 pacientes ativos com doença de Crohn. Pacientes com Índice de Atividade da Doença de Crohn (CDAI) > 200 que não responderam a esteróides, imunossupressores ou anti-TNF foram randomizados para receber 2 cigarros de cannabis ou placebo diariamente. Cada cigarro continha 0,5 g de cannabis, correspondendo a 11,5 mg de Tetrahidrocanabinol (THC). O placebo continha folhas de cannabis das quais o THC foi extraído. Durante o tratamento, o CDAI mudou no grupo cannabis de 358 ± 99 para 139±111 (p<0,05) e no grupo placebo de 373 ± 94 para 306±143 (p=Não significativo). Cinco pacientes no grupo cannabis e um no grupo placebo entraram em remissão completa (CDAI <100). Três pacientes dependentes de esteroides no grupo da cannabis interromperam os esteroides durante o estudo. Os pacientes relataram melhora do apetite e do sono, sem efeitos colaterais graves.

Estes dados preliminares indicam que os canabinóides têm um grande potencial no tratamento da doença de Crohn, mas é claramente necessária uma investigação mais aprofundada da sua influência, modo de ação, canabinóides ativos e não ativos e vias alternativas de aplicação. O mais importante é saber se a melhora observada com o consumo de cannabis é apenas sintomática ou se há uma melhora real na inflamação.

O objetivo do estudo proposto é avaliar a inflamação e os níveis de citocinas em explantes de tecido colônico de pacientes com DII com e sem canabidiol.

Materiais e métodos:

População do estudo: Pacientes com doença de Crohn ou colite ulcerosa agendados para colonoscopia conforme considerado necessário por seu médico serão elegíveis para o estudo. Depois de obter o consentimento informado, as biópsias de tecido inflamado e normal serão coletadas e processadas em um meio de cultura de tecidos, conforme descrito a seguir. Haverá 6 biópsias de cada local.

Métodos:

Os explantes serão cultivados em grupos de três com a superfície do vilo para cima em membranas microporosas (0,45-_m de tamanho de poro) contidas em inserções de cultura de tecidos Millicell-HA (Millipore). Os insertos serão colocados em placas plásticas de cultura de tecidos de 6 poços (Costar 3506) juntamente com 1,5 ml de meio de cultura de tecidos. O meio de cultura de tecidos será meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 μg/ml), leupeptina (50 μg/ml), PMSF (1 mM), soja inibidor de tripsina (50 μg/ml) e dexametasona (200 μg/ml). As culturas serão incubadas em incubadora a 37°C e gaseificadas a cada hora com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Serão obtidas seis biópsias de cada local. Três biópsias servirão como controle e três serão cultivadas com adição de Canabidiol (1 μg/ml). Após 24 horas, a viabilidade do tecido será avaliada pela adição de Alamar a uma de cada 3 amostras. A mudança de cor de roxo para rosa indica tecido viável. O sobrenadante das outras 4 biópsias será coletado e congelado a -20°C. As biópsias serão então colocadas em formalina para inspeção anatomopatológica.

O sobrenadante das amostras controladas e tratadas com cannabis será analisado quanto à presença e nível de TNF alfa, Interferon gama, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 e IL-6.