Cytokinproduktion av kolonvävnad från IBD-patienter

Projektets titel:

Cannabinoiders effektivitet vid behandling av inflammatorisk tarmsjukdom

Fråga som ska utredas:

Marijuanaväxten, Cannabis sativa, har använts som medicinsk behandling för en mängd olika sjukdomar. Cannabinoider har rapporterats lindra neurologiska tillstånd inklusive MS-relaterade symtom som spasticitet, smärta, tremor och dysfunktion i urinblåsan. Andra neurologiska tillstånd, såsom kronisk svårbehandlad smärta, dystoniska rörelsestörningar och Tourettes syndrom rapporterades också lindras av cannabisanvändning. Cannabis har använts för att behandla anorexi hos AIDS- och cancerpatienter. Inom gastroenterologi har cannabis använts för att behandla anorexi, kräkningar, buksmärtor, gastroenterit, diarré, tarminflammation och diabetisk gastropares.

Cannabisväxten innehåller över 60 olika föreningar som tillsammans kallas cannabinoider. Av dessa verkar de två föreningarna delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) och Cannabidiol (CBD) vara de mest aktiva.

Cannabinoider har en djupgående antiinflammatorisk effekt, främst genom CB2-receptorn. Cellmedierad immunitet visade sig vara nedsatt hos kroniska marijuanaanvändare. En potent antiinflammatorisk effekt av cannabis observerades hos gnagare. Att studera endocannabinoidsystemets funktionella roller i immunmodulering visar att det är involverat i nästan alla större immunhändelser. Cannabinoider flyttar balansen mellan pro-inflammatoriska cytokiner och antiinflammatoriska cytokiner mot T-hjälparcell typ 2-profiler (Th2-fenotyp) och undertrycker cellmedierad immunitet, medan humoral immunitet kan förbättras. Cannabidiol visade sig minska inflammation i en musmodell av reumatoid artrit och typ I-diabetes mellitus.

Därför kan cannabinoider användas för att behandla olika inflammatoriska tillstånd inklusive reumatoid artrit och astma.

I tarmen produceras endocannabinoider av både den serosala och mukosala komponenten i den mänskliga tarmen, och studier på cellinjer har visat att mänskliga tarmepitelceller kan producera endocannabinoider; ytterligare källor till endocannabinoider i tarmen inkluderar mänskliga endotelceller, blodplättar, bosatta makrofager och andra immunceller såsom lymfocyter. CB1- och CB2-receptorer uppregleras i experimentella modeller av inflammatorisk tarmsjukdom. I en musmodell av kolit visade sig cannabinoider lindra inflammation, och i den mänskliga tarmen ökar nivåerna av anandamid under inflammation. Den inflammerade tunntarmen har också signifikant förhöjd aktivitet av FAAH såväl som uttryck av CB1 cannabinoidreceptorer.

De exakta cellulära målen som är inblandade i minskningen av inflammation av cannabinoider är okända. I en modell av bronkopulmonell inflammation hos möss minskade administrering av anandamid TNF-alfa-nivåer i bronkoalveolär sköljvätska. Delta 9-tetrahydrocannabinol (THC) hämmar syntesen av IL-12, IL-2, IL-6, INF gamma och T-cellsproliferation.

Många patienter med IBD rapporterar att rökning av marihuana förbättrade deras symtom, men det finns inga kliniska studier som undersöker den observationen. Vi har nyligen publicerat den första rapporterade observationen av användning av medicinsk cannabis vid Crohns sjukdom. I vår studie av 30 patienter förbättrades 21 signifikant efter behandling med cannabis. Det genomsnittliga Harvey Bradshaw-indexet förbättrades från 14 ± 6,7 till 7 ± 4,7 (P < 0,001). Antalet tarmrörelser minskade från i genomsnitt åtta per dag till fem per dag och behovet av annan medicinering, särskilt steroider, minskade avsevärt. Mot bakgrund av dessa resultat genomförde vi en dubbelblind placebokontrollerad studie på 20 aktiva patienter med Crohns sjukdom. Patienter med Crohns sjukdomsaktivitetsindex (CDAI) >200 som inte svarade på steroider, immunsuppressiva medel eller anti-TNF randomiserades till att få 2 cigaretter cannabis eller placebo dagligen. Varje cigarett innehöll 0,5 g cannabis, motsvarande 11,5 mg tetrahydrocannabinol (THC). Placebo innehöll cannabisblad från vilka THC extraherades. Under behandlingen ändrades CDAI i cannabisgruppen från 358 ± 99 till 139±111 (p<0,05) och i placebogruppen från 373 ± 94 till 306±143 (p=icke signifikant). Fem patienter i cannabisgruppen och en i placebogruppen gick i fullständig remission (CDAI <100). Tre steroidberoende patienter i cannabisgruppen slutade med steroider under studien. Patienterna rapporterade förbättrad aptit och sömn, utan några allvarliga biverkningar.

Dessa preliminära data indikerar att cannabinoider har en stor potential vid behandling av Crohns sjukdom, men ytterligare utredning av deras inflytande, verkningssätt, aktiva och icke-aktiva cannabinoider och alternativa appliceringsvägar behövs helt klart. Viktigast är frågan om den förbättring som observeras med cannabiskonsumtion endast är symtomatisk eller om det finns en verklig förbättring av inflammationen.

Syftet med den föreslagna studien är att utvärdera inflammation och cytokinnivåer i explantat av kolonvävnad från IBD-patienter med och utan cannabidiol.

Material och metoder:

Studiepopulation: Patienter med antingen Crohns sjukdom eller ulcerös kolit schemalagda för koloskopi som bedöms nödvändigt av deras läkare kommer att vara berättigade till studien. Efter att ha erhållit informerat samtycke kommer biopsier från inflammerad och normal vävnad att tas och bearbetas i ett vävnadsodlingsmedium som beskrivs vidare. Det kommer att finnas 6 biopsier från varje plats.

Metoder:

Explantat kommer att odlas i grupper om tre med villusytan uppe på mikroporösa membran (0,45-_m porstorlek) som finns i Millicell-HA vävnadskulturinlägg (Millipore). Insatserna kommer att placeras i vävnadsodlingsskålar av plast med 6 brunnar (Costar 3506) tillsammans med 1,5 ml vävnadsodlingsmedium. Vävnadsodlingsmedium kommer att vara Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum, penicillin (100 enheter/ml), streptomycin (100 μg/ml), leupeptin (50 μg/ml), PMSF (1 mM), sojaböna trypsinhämmare (50 μg/ml) och dexametason (200 μg/ml). Kulturer kommer att inkuberas vid 37°C inkubator och gasas varje timme med 95 % syre 5 % koldioxid. Sex biopsier från varje plats kommer att erhållas. Tre biopsier kommer att fungera som en kontroll och tre kommer att odlas med tillsats av Cannabidiol (1 μg/ml). Efter 24 timmar kommer vävnadsviabiliteten att bedömas genom tillsats av Alamar till ett av varje 3 prov. Ändring av färg från lila till rosa indikerar livsduglig vävnad. Supernatanten från de andra 4 biopsierna kommer att samlas in och frysas vid -20°C. Biopsierna kommer sedan att placeras i formalin för patologisk inspektion.

Supernatanten från kontrollerade och cannabisbehandlade prover kommer att analyseras med avseende på närvaro och nivå av TNF alfa, Interferon gamma, IL-23, IL-12, IL-2, IL-10, IL-17 och IL-6.