Metformin snižuje míru relapsů u pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií s prekurzorem B-buněk (Ph+ negativní)

Geny MDR (multidrug-Resistance) se podílejí na odolnosti několika typů rakoviny. Nejdůležitější na leukémii jsou ABCB1 a ABCG2-ABCB1 se podílejí na rezistenci a závažnosti akutní myeloidní leukémie a dětské akutní lymfoblastické leukémie. Tyto transportéry používají k použití ATP. Metformin snižuje intracelulární rezervu ATP (adenosintrifosfát) aktivací AMPK. Nedávno na rakovinné buněčné linii MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, buněčná linie rakoviny prsu) blokuje metformin funkci P-glykoproteinu inhibicí nukleárního faktoru -kappa-B.

Klinické důkazy jsou v tuto chvíli omezené, založené na malých klinických studiích nebo pozorovacích studiích. Tato studie se pokouší vyhodnotit účinek přidání metforminu do standardního chemoterapeutického režimu u pacientů, kteří exprimují vysoké hladiny exprese mRNA (messenger ribonukleové kyseliny) ABCB1

Experimentální protokol

Pacienti budou stratifikováni do tří skupin: Vysoká exprese, nízká exprese a chybějící genová exprese podle hladiny mRNA ABCB1 při diagnostice. Vzorky jsou získány z mononukleárních buněk periferní krve

Extrakce celkové RNA Celková RNA byla izolována pomocí TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) podle doporučení výrobce popsaných Chomczynskim a Sacchim.

Koncentrace a čistota celkové RNA byla stanovena na UV-vis spektrofotometru (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). Integrita genetického materiálu byla potvrzena elektroforézou na 1,5% agarózovém gelu při 70 V po dobu 40 minut. RNA byla skladována při -80 °C, dokud nebyla potřeba.

Syntéza cDNA Pro syntézu c DNA (komplementární deoxyribonukleové kyseliny) bylo použito množství RNA 2 ug na konečný objem 20 ug. RNA byla smíchána s 1 ul oligonukleotidu 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) a 1 ul de dNTPs (deoxynukleosidtrifosfát) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Po přidání 4 ul pufru 5 X (Tris-HCl (kyselina chlorovodíková) 250 mM, KCl (chlorid draselný) 375 mM MgCl2 15 mM), 2 ul de DTT (dithiothreitol) (0,1 M) a vody byla veškerá směs inkubována při 37 °C po dobu dvou minut a 1 ul MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus reverzní transkriptáza) enzymu reverzní transkriptázy (200u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) a inkubováno při 37 °C po dobu 50 minut.

Analýza polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT-PCR) Hladiny exprese mRNA genů ABCB1 (Hs01069047) a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH; Hs00985689) byly měřeny pomocí testu genové exprese TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , CA, USA). Gen GAPDH byl použit jako endogenní kontrola a každý vzorek byl analyzován v triplikátech. Relativní hladiny exprese byly vypočteny pomocí metody 2-AACt s kostní dření jako kalibrátorem. Vysoké a nízké hraniční hodnoty exprese byly určeny středními hodnotami pozorovanými u zdravých dárců.

Protokol léčby Všichni pacienti dostávají indukční remisní léčbu s úvodní preindukční fází steroidy (prednisonem) ode dne -7 do dne -1 (-7 ,-6 = 25 mg , -5 , -4 : 50 mg , -3, -2: 75 mg a v den -1: 100 mg). Léčba indukční remise je založena na 28denní léčbě prednisonem (60 mg/m2), Vinkristinem (1,5 mg/m2 max. 2 mg) a Daunorubicinem 60 mg/m2 ve dnech +1, +8 a +15. Pokud pacient archivuje kompletní remisi, pokračuje konsolidační terapií se sekvenčními bloky léčby, která zahrnuje cytarabin, etoposid, methotrexát. Pokud pacient na konci konsolidační terapie stále v remisi pokračuje v udržovací fázi, která zahrnuje 6-merkaptopurin a týdenní dávku methotrexátu po dobu přibližně dvou let

Reakce 28. den indukční remisní léčby budou podle výsledku vzorku kostní dřeně pacienti prohlášeni za remisní (méně než 5 % blastů) nebo refrakterní (> 5 % blastických buněk). Pokud má pacient v kterémkoli bodě léčby zvýšený počet blastů v kostní dřeni, pacient je považován za relaps.