A metformina reduz a taxa de recaída em pacientes com leucemia linfoblástica aguda precursora de células B (Ph+ negativa)

Os genes MDR (Multidrug-Resistance) estão implicados na resistência de vários tipos de câncer. Os mais importantes na leucemia são o ABCB1 e o ABCG2- ABCB1 estão implicados na resistência e gravidade da Leucemia Mielóide Aguda e da Leucemia Linfoblástica Aguda pediátrica. Esses transportadores usam ATP para uso. A metformina diminui a reserva intracelular de ATP (trifosfato de adenosina) pela ativação da AMPK. Recentemente, na linha celular de câncer MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, linha celular de câncer de mama), a metformina bloqueia a função da glicoproteína P pela inibição do Fator Nuclear -kappa-B.

A evidência clínica neste momento é limitada, baseada em pequenos ensaios clínicos ou estudos observacionais. Este estudo tenta avaliar o efeito da adição de Metformina a um regime quimioterápico padrão em pacientes que expressam altos níveis de expressão do mRNA (ácido ribonucléico mensageiro) ABCB1

protocolo experimental

Os pacientes serão estratificados em três grupos: Alta expressão, baixa expressão e ausência de expressão gênica de acordo com o nível de mRNA de ABCB1 no momento do diagnóstico. As amostras são obtidas de células sanguíneas periféricas mononucleares

Extração do RNA total O RNA total foi isolado por TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) de acordo com as recomendações do fabricante descritas por Chomczynski e Sacchi.

A concentração e a pureza do RNA total foram determinadas em um espectrofotômetro UV-vis (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). A integridade do material genético foi confirmada por eletroforese em gel de agarose 1,5% a 70 V por 40 min. O ARN foi armazenado a -80°C até ser necessário.

Síntese de cDNA Para a síntese de c DNA (ácido desoxirribonucléico complementar) a quantidade de RNA utilizada foi de 2 µg para um volume final de 20 µg. O ARN foi misturado com 1 µl de oligonucleótido 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) e 1 µl de dNTPs (desoxinucleósido trifosfato) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Após a adição de 4 µl de Buffer 5 X (Tris-HCl (ácido clorídrico) 250mM, KCl (cloreto de potássio) 375 mM MgCl2 15mM), 2 µl de DTT (ditiotreitol) (0,1M) e água, toda a mistura foi incubada a 37° por dois minutos e 1 µl de MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) enzima transcriptase reversa (200u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) e incubado a 37°C por 50 minutos.

Análise de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) Os níveis de expressão de mRNA dos genes ABCB1 (Hs01069047) e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Hs00985689) foram medidos usando o ensaio de expressão gênica TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , CA, EUA). O gene GAPDH foi usado como controle endógeno e cada amostra foi analisada em triplicata. Os níveis de expressão relativa foram calculados usando o método 2-ΔΔCt com medula óssea como calibrador. Os pontos de corte de alta e baixa expressão foram determinados pelos valores médios observados em doadores saudáveis.

Protocolo de tratamento Todos os pacientes recebem um tratamento de remissão por indução com uma fase inicial de pré-indução com esteróides (prednisona) do dia -7 ao dia -1 (-7 ,-6 = 25mg , -5 , -4 : 50mg , -3, -2: 75mg e no dia -1: 100mg). O tratamento de remissão por indução baseia-se num tratamento de 28 dias com prednisona (60mg/m2), Vincristina (1,5mg/m2 máx. 2mg) e Daunorrubicina 60mg/m2 nos dias +1, +8 e +15. Se o paciente arquivar uma Remissão Completa, continua com uma terapia de consolidação com blocos sequenciais de tratamento que inclui Citarabina, Etoposido, Metotrexato. Se o paciente ainda em remissão no final da terapia de consolidação continuar na fase de manutenção que inclui 6-mercaptopurina e uma dose semanal de metotrexato por cerca de dois anos

Resposta No dia 28 do tratamento de remissão de indução, de acordo com o resultado da amostra de medula óssea, os pacientes serão declarados em remissão (menos de 5% de blastos) ou refratários (>5% de blastos). Se o paciente apresentar em qualquer ponto do tratamento um aumento na contagem de blastos da medula óssea, o paciente é considerado em recaída.