Metformin Reduser tilbakefallsfrekvensen hos pasienter med B-celleforløper (Ph+ negativ) akutt lymfoblastisk leukemi

MDR-genene (Multidrug-Resistance) er involvert i motstanden til flere typer kreft. De viktigste på leukemi er ABCB1 og ABCG2-ABCB1 er implisert på resistens og alvorlighetsgrad på akutt myeloid leukemi og pediatrisk akutt lymfatisk leukemi. Disse transportørene bruker ATP til bruk. Metformin reduserer den intracellulære ATP (Adenosintrifosfat)-reserven ved aktivering av AMPK. Nylig på MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, brystkreftcellelinje) kreftcellelinje, blokkerer Metformin funksjonen til P-glykoproteinet ved å hemme Nuclear Factor -kappa-B.

Den kliniske bevis for øyeblikket er begrenset, basert på små kliniske studier eller observasjonsstudier. Denne studien prøver å evaluere effekten av tilsetning av Metformin til et standard kjemoterapiregime på pasienter som uttrykker høye nivåer av ekspresjon av mRNA (messenger ribonukleinsyre) ABCB1

Eksperimentell protokoll

Pasientene vil bli stratifisert i tre grupper: Høyekspresjon, lav ekspresjon og fraværende genuttrykk i henhold til nivået mRNA til ABCB1 ved diagnostikk. Prøvene er hentet fra mononukleære perifere blodceller

Ekstraksjon av totalt RNA Totalt RNA ble isolert med TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) i henhold til produsentens anbefalinger beskrevet av Chomczynski og Sacchi.

Konsentrasjonen og renheten av totalt RNA ble bestemt i et UV-vis spektrofotometer (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). Integriteten til det genetiske materialet ble bekreftet ved 1,5 % agarosegelelektroforese ved 70 V i 40 minutter. RNA ble lagret ved -80°C inntil nødvendig.

Syntese av cDNA Ved syntese av c DNA (komplementær deoksyribonukleinsyre) var mengden RNA brukt 2 µg for et sluttvolum på 20 µg. RNA ble blandet med 1 ul oligonukleotid 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) og 1 ul de dNTPs (deoksynukleosidtrifosfat) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Etter tilsetning av 4 µl Buffer 5 X (Tris-HCl (saltsyre) 250 mM, KCl (kaliumklorid) 375 mM MgCl2 15 mM), 2 µl de DTT (ditiotreitol) (0,1 M) og vann, ble all blandingen inkubert ved 37° i to minutter og 1 µl MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) Revers transkriptase-enzym (200u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) og inkubert ved 37°C i 50 minutter.

Sanntidsanalyse av polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) mRNA-ekspresjonsnivåene til ABCB1 (Hs01069047) og glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenase (GAPDH; Hs00985689) gener ble målt ved å bruke TaqMan® genekspresjonsanalyse (Applied Biosystems, Foster City, , CA, USA). GAPDH-genet ble brukt som en endogen kontroll, og hver prøve ble analysert i tre eksemplarer. De relative ekspresjonsnivåene ble beregnet ved å bruke 2-ΔΔCt-metoden med benmarg som kalibrator. De høye og lave ekspresjonsgrensepunktene ble bestemt av gjennomsnittsverdiene observert hos friske givere.

Behandlingsprotokoll Alle pasientene får en induksjonsremisjonsbehandling med en innledende pre-induksjonsfase med steroider (prednison) fra dag -7 til dag -1 (-7 ,-6 = 25mg , -5 , -4 : 50mg , -3, -2: 75 mg og på dag -1: 100 mg). Induksjonsremisjonsbehandlingen er basert på en 28 dagers behandling med prednison (60mg/m2), Vincristine (1,5mg/m2 maks 2mg) og Daunorubicin 60mg/m2 på dagene +1, +8 og +15. Hvis pasienten arkiverer en fullstendig remisjon, fortsetter med en konsolideringsterapi med sekvensielle blokker av behandling som inkluderer Cytarabin, Etoposid, Metotreksat. Hvis pasienten fortsatt er i remisjon ved slutten av konsolideringsterapien fortsetter i vedlikeholdsfasen som inkluderer 6-merkaptopurin og en ukentlig dose metotreksat i rundt to år

Respons På dag 28 av induksjonsremisjonsbehandlingen vil pasientene i henhold til resultatet av benmargsprøven bli erklært for remisjon (mindre enn 5 % blast) eller refraktær (>5 % blastcelle). Hvis pasienten tilstede på et hvilket som helst tidspunkt av behandlingen en økning i antall benmargsblaster, vurderes pasienten som tilbakefall.