Metformina zmniejsza częstość nawrotów u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną prekursorową limfocytów B (Ph+ ujemny)

Geny MDR (Multidrug-Resistance) są zaangażowane w oporność kilku rodzajów raka. Najważniejsze w białaczce są ABCB1 i ABCG2- ABCB1 są związane z opornością i ciężkością ostrej białaczki szpikowej i ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci. Te transportery używają ATP do użytku. Metformina zmniejsza wewnątrzkomórkową rezerwę ATP (trifosforan adenozyny) poprzez aktywację AMPK. Ostatnio na linii komórkowej raka MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, linia komórkowa raka piersi) metformina blokuje funkcję P-glikoproteiny przez hamowanie czynnika jądrowego -kappa-B.

Dowody kliniczne w tej chwili są ograniczone i opierają się na małych badaniach klinicznych lub badaniach obserwacyjnych. W tym badaniu podjęto próbę oceny wpływu dodania metforminy do standardowego schematu chemioterapii u pacjentów, u których występuje wysoki poziom ekspresji mRNA (wiadomościowy kwas rybonukleinowy) ABCB1

eksperymentalny protokół

Pacjenci zostaną podzieleni na trzy grupy: o wysokiej ekspresji, niskiej ekspresji i braku ekspresji genu zgodnie z poziomem mRNA ABCB1 w diagnostyce. Próbki uzyskuje się z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej

Ekstrakcja całkowitego RNA Całkowity RNA wyizolowano metodą TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) zgodnie z zaleceniami producenta opisanymi przez Chomczyńskiego i Sacchi.

Stężenie i czystość całkowitego RNA określono w spektrofotometrze UV-vis (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). Integralność materiału genetycznego potwierdzono przez elektroforezę w 1,5% żelu agarozowym przy 70 V przez 40 min. RNA przechowywano w -80°C do czasu użycia.

Synteza cDNA Do syntezy cDNA (komplementarnego kwasu dezoksyrybonukleinowego) użyto 2 µg RNA do końcowej objętości 20 µg. RNA zmieszano z 1 ul oligonukleotydu 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) i 1 ul dNTPs (trójfosforan dezoksynukleozydu) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Po dodaniu 4 µl buforu 5 X (Tris-HCl (kwas chlorowodorowy) 250 mM, KCl (chlorek potasu) 375 mM MgCl2 15 mM), 2 µl de DTT (ditiotreitol) (0,1 M) i wody, całość inkubowano w temperaturze 37° przez dwie minuty i 1 ul MMLV (odwrotna transkryptaza wirusa mysiej białaczki Moloneya) enzymu odwrotnej transkryptazy (200 u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 50 minut.

Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) Poziomy ekspresji mRNA genów ABCB1 (Hs01069047) i dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu (GAPDH; Hs00985689) mierzono za pomocą testu ekspresji genów TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , Kalifornia, Stany Zjednoczone). Gen GAPDH zastosowano jako kontrolę endogenną, a każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach. Względne poziomy ekspresji obliczono stosując metodę 2-ΔΔCt ze szpikiem kostnym jako kalibratorem. Wysokie i niskie punkty odcięcia ekspresji określono na podstawie średnich wartości obserwowanych u zdrowych dawców.

Protokół leczenia Wszyscy chorzy otrzymują leczenie indukcyjno-remisyjne ze wstępną fazą preindukującą sterydami (prednizon) od dnia -7 do dnia -1 (-7 ,-6 = 25mg , -5 , -4 : 50mg , -3, -2: 75mg i w dniu -1: 100mg). Leczenie indukcji remisji opiera się na 28-dniowej kuracji prednizonem (60mg/m2), winkrystyną (1,5mg/m2 max 2mg) i daunorubicyną 60mg/m2 w dniach +1, +8 i +15. Jeśli pacjent osiągnie całkowitą remisję, kontynuuje terapię konsolidacyjną z sekwencyjnymi blokami leczenia, które obejmują cytarabinę, etopozyd, metotreksat. Jeśli po zakończeniu leczenia konsolidacyjnego pacjent nadal jest w stanie remisji, kontynuuje fazę podtrzymującą obejmującą 6-merkaptopurynę i cotygodniową dawkę metotreksatu przez około dwa lata

Odpowiedź W 28. dniu leczenia indukującego remisję, w zależności od wyniku badania szpiku, pacjent zostanie uznany za remisję (poniżej 5% blastów) lub oporną na leczenie (>5% blastów). Jeśli u pacjenta w dowolnym momencie leczenia wystąpi wzrost liczby blastów w szpiku kostnym, uważa się, że pacjent ma nawrót choroby.