Метформин снижает частоту рецидивов у пациентов с В-клеточным предшественником (Ph+ отрицательный) острым лимфобластным лейкозом

Гены MDR (множественной лекарственной устойчивости) связаны с устойчивостью к нескольким типам рака. Наиболее важными при лейкемии являются ABCB1 и ABCG2. ABCB1 влияют на резистентность и тяжесть течения острого миелоидного лейкоза и острого лимфобластного лейкоза у детей. Эти транспортеры используют АТФ для использования. Метформин снижает внутриклеточный запас АТФ (аденозинтрифосфата) за счет активации AMPK. Недавно на линии раковых клеток MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, линия клеток рака молочной железы) метформин блокировал функцию P-гликопротеина путем ингибирования ядерного фактора -каппа-B.

Клинические данные на данный момент ограничены, они основаны на небольших клинических испытаниях или обсервационных исследованиях. В этом исследовании делается попытка оценить эффект добавления метформина к стандартной схеме химиотерапии у пациентов с высоким уровнем экспрессии мРНК (посылочной рибонуклеиновой кислоты) ABCB1.

Экспериментальный протокол

Пациенты будут разделены на три группы: с высокой экспрессией, низкой экспрессией и отсутствием экспрессии гена в соответствии с уровнем мРНК ABCB1 при диагностике. Образцы получены из мононуклеарных клеток периферической крови.

Экстракция тотальной РНК Тотальную РНК выделяли с помощью TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) в соответствии с рекомендациями производителя, описанными Chomczynski и Sacchi.

Концентрацию и чистоту тотальной РНК определяли на спектрофотометре в УФ-видимой области (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). Целостность генетического материала подтверждали электрофорезом в 1,5% агарозном геле при 70 В в течение 40 мин. РНК хранили при -80°C до тех пор, пока она не понадобится.

Синтез кДНК. Для синтеза кДНК (комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты) количество используемой РНК составляло 2 мкг для конечного объема 20 мкг. РНК смешивали с 1 мкл олигонуклеотида 12-18 (INVITROGEN, Карлсбад, Калифорния) и 1 мкл de dNTPs (дезоксинуклеозидтрифосфат) 10 мМ (Applied Biosystems, Roche). После добавления 4 мкл буфера 5 X (Tris-HCl (соляная кислота) 250 мМ, KCl (хлорид калия) 375 мМ MgCl2 15 мМ), 2 мкл де-ДТТ (дитиотреитола) (0,1 М) и воды всю смесь инкубировали. при 37° в течение двух минут и 1 мкл MMLV (обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Молони) фермента обратной транскриптазы (200 ед.) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) и инкубировали при 37°C в течение 50 минут.

Анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) Уровни экспрессии мРНК генов ABCB1 (Hs01069047) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH; Hs00985689) измеряли с использованием анализа экспрессии генов TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City , Калифорния, США). Ген GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля, и каждый образец анализировали в трех повторностях. Относительные уровни экспрессии рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCt с костным мозгом в качестве калибратора. Пороговые значения высокой и низкой экспрессии определяли по средним значениям, наблюдаемым у здоровых доноров.

Протокол лечения Все пациенты получают лечение для индукции ремиссии с начальной преиндукционной фазой со стероидами (преднизолон) с -7 до -1 дня (-7, -6 = 25 мг, -5, -4: 50 мг, -3, -2: 75 мг и в день -1: 100 мг). Лечение индукции ремиссии основано на 28-дневном лечении преднизоном (60 мг/м2), винкристином (1,5 мг/м2, максимум 2 мг) и даунорубицином 60 мг/м2 в дни +1, +8 и +15. Если у пациента наступила полная ремиссия, продолжайте консолидирующую терапию с последовательными блоками лечения, включающими цитарабин, этопозид, метотрексат. Если пациент все еще находится в ремиссии в конце консолидирующей терапии, продолжается поддерживающая фаза, которая включает 6-меркаптопурин и еженедельную дозу метотрексата в течение примерно двух лет.

Реакция На 28-й день индукционной ремиссии, по результатам исследования образца костного мозга, у пациентов будет объявлена ​​ремиссия (менее 5% бластных клеток) или рефрактерная (> 5% бластных клеток). Если у пациента в какой-либо момент лечения наблюдается увеличение количества бластов в костном мозге, считается, что у пациента рецидив.