Metformin Minska återfallsfrekvensen hos patienter med B-cellsprekursor (Ph+ negativ) Akut lymfoblastisk leukemi

MDR-generna (Multidrug-Resistance) är inblandade i resistensen hos flera typer av cancer. De viktigaste på leukemi är ABCB1 och ABCG2-ABCB1 är inblandade i resistens och svårighetsgrad vid akut myeloid leukemi och pediatrisk akut lymfatisk leukemi. Dessa transportörer använder ATP för användning. Metformin minskar den intracellulära ATP (Adenosintrifosfat)-reserven genom aktivering av AMPK. Nyligen på MCF7-Adr (Michigan Cancer Foundation 7, bröstcancercellinje) cancercellinje, blockerar Metformin funktionen av P-glykoproteinet genom hämning av Nuclear Factor -kappa-B.

Det kliniska beviset för närvarande är begränsat, baserat på små kliniska prövningar eller observationsstudier. Denna studie försöker utvärdera effekten av tillägg av Metformin till en standard kemoterapiregim på patienter som uttrycker höga nivåer av uttryck av mRNA (budbärarribonukleinsyra) ABCB1

Experimentellt protokoll

Patienterna kommer att stratifieras i tre grupper: högt uttryck, lågt uttryck och frånvarande genuttryck enligt nivån mRNA för ABCB1 vid diagnostik. Proverna erhålls från mononukleära perifera blodkroppar

Extraktion av totalt RNA Totalt RNA isolerades med TRIzol® (Invtirogen Life Technologies) enligt tillverkarens rekommendationer som beskrivs av Chomczynski och Sacchi.

Koncentrationen och renheten av totalt RNA bestämdes i en UV-vis-spektrofotometer (Thermo Scientific, Genesis 10S UV-vis). Integriteten hos det genetiska materialet bekräftades genom 1,5 % agarosgelelektrofores vid 70 V under 40 minuter. RNA:t lagrades vid -80°C tills det behövdes.

Syntes av cDNA Vid syntes av c DNA (komplementär deoxiribonukleinsyra) var mängden RNA som användes 2 µg för en slutlig volym av 20 µg. RNA:t blandades med 1 ul oligonukleotid 12-18 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) och 1 ul de dNTPs (deoxinukleosidtrifosfat) 10 mM (Applied Biosystems, Roche). Efter tillsats av 4 µl Buffert 5 X (Tris-HCl (saltsyra) 250 mM, KCl (kaliumklorid) 375 mM MgCl2 15 mM), 2 µl de DTT (ditiotreitol) (0,1 M) och vatten, inkuberades all blandning vid 37° i två minuter och 1 µl MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) Omvänt transkriptas-enzym (200u) (INVITROGEN, Carlsbad, CA) och inkuberades vid 37°C i 50 minuter.

Analys av polymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR) mRNA-expressionsnivåerna för generna ABCB1 (Hs01069047) och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH; Hs00985689) mättes med hjälp av TaqMan®-genexpressionsanalysen (Applied Biosystems, Foster City, , CA, USA). GAPDH-genen användes som en endogen kontroll, och varje prov analyserades i tre exemplar. De relativa uttrycksnivåerna beräknades med användning av 2-ΔACt-metoden med benmärg som kalibrator. De höga och låga uttrycksgränspunkterna bestämdes av medelvärdena som observerades hos friska donatorer.

Behandlingsprotokoll Alla patienter får en induktionsremissionsbehandling med en initial pre-induktionsfas med steroider (prednison) från dag -7 till dag -1 (-7 ,-6 = 25mg , -5 , -4 : 50mg , -3, -2: 75 mg och på dag -1: 100 mg). Induktionsbehandlingen baseras på en 28 dagars behandling med prednison (60mg/m2), Vincristine (1,5mg/m2 max 2mg) och Daunorubicin 60mg/m2 dagarna +1, +8 och +15. Om patienten arkiverar en fullständig remission, fortsätter med en konsolideringsterapi med sekventiella behandlingsblock som inkluderar Cytarabin, Etoposid, Metotrexat. Om patienten fortfarande är i remission i slutet av konsolideringsterapin fortsätter i underhållsfasen som inkluderar 6-merkaptopurin och en veckodos metotrexat i cirka två år

Svar På dag 28 av induktionsremissionsbehandlingen, enligt resultatet av benmärgsprovet, kommer patienten att deklareras som remission (mindre än 5 % blast) eller refraktär (>5 % blastcell). Om patienten vid något tillfälle av behandlingen uppträder en ökning av antalet benmärgsblaster, anses patienten ha återfall.