Ustoupit přístup u dětí s alergií na kravské mléko (SDACMA)

K účasti ve studii bude pozváno 60 dětí CMA zprostředkované imunoglobulinem E, které byly následně sledovány v terciárních centrech pro potravinovou alergii a které splní kritéria pro zařazení. Anamnestické, demografické, antropometrické a klinické údaje, stejně jako informace o sociodemografických faktorech, rodinných a životních podmínkách, rodičovské anamnéze alergických onemocnění, počtu sourozenců a vlastnictví domácího mazlíčka budou získány od rodičů každého kojence a zaznamenány v klinická databáze.

Poté bude u všech subjektů proveden orální potravinový test s EHCF + LGG. Pouze jedinci s negativní orální expozicí potravin budou náhodně rozděleni do jedné ze dvou skupin dietních intervencí po dobu 12 měsíců sledování: skupina 1 dostávala AAF a skupina 2 dostávala EHCF + LGG.

Efektivní použití vzorce bude během studie hodnoceno dietologem, který bude rodičům radit o problémech, které by mohly nastat během eliminační diety. Rodiče nebo pečovatelé budou požádáni, aby si vedli denní záznamy o používání umělé výživy. Připravené množství (milimetry vody a počet umělých lžic) a zbývající množství po každé konzumaci se zaznamená do deníku pro posouzení zkonzumovaného množství dítětem.

Při zápisu bude po 6 a 12 měsících tělesný růst hodnocen podle tělesné hmotnosti, délky těla a obvodu hlavy měřených při zápisu, po 6 a 12 měsících sledování s odkazem na růstové tabulky. V případě potřeby budou uskutečněny neplánované návštěvy.

Kromě toho při zápisu, po 6 a 12 měsících, vyšetřovatelé provedou:

1. Všechny procedury perorálního provokačního testu s jídlem budou prováděny dvojitě slepým způsobem ve 2 po sobě jdoucích dnech. K dispozici bude kompletní pohotovostní vybavení a léky (epinefrin, antihistaminika, steroidy). Vyvolání bude zastaveno po objevení se klinických příznaků nebo když bude dosaženo nejvyšší dávky. Dítě bude sledováno 2 hodiny a poté propuštěno.
2. Kožní prick test (plnotučné mléko, kasein, α-laktalbumin, β-laktoglobulin): alergeny a čerstvé mléko budou pacientům aplikovány na volární předloktí: kravské mléko (KM) s obsahem 3,5 % tuku. Kožní prick testy byly provedeny za použití 1 mm lancety s jedním vrcholem (ALK, Kodaň, Dánsko), s dihydrochloridem histaminu (10 mg/ml) a izotonickým fyziologickým roztokem (NaCl 0,9 %) jako pozitivní a negativní kontrolou, v daném pořadí. Reakce budou zaznamenávány na základě největšího průměru (v milimetrech) praskliny a vzplanutí po 15 minutách. Výsledek SPT bude považován za „pozitivní“, pokud byla pupečníková rána 3 mm nebo větší, bez reakce negativní kontroly.
3. Celkové IgE a specifické IgE a Imunoglobulin G 4 proti proteinům a epitopům kravského mléka: provedeme odběr žilní krve; sérum pacientů se odebere pomocí zkumavek se separátorem séra a získá se centrifugací po dobu 10-15 minut. Sérum bude bleskově zmrazeno a skladováno při -80 °C až do další analýzy. Ze séra budou enzymatickým imunotestem analyzovány celkové IgE a specifické IgE a IgG4 proti proteinům a epitopům kravského mléka.
4. Složení střevní mikroflóry: odebere se vzorek stolice, který se okamžitě zmrazí na -80 °C a uloží do další analýzy. Celková genomová DNA (gDNA) bude izolována z fekálního materiálu pomocí specifické DNA. Izolační souprava a složení střevní mikroflóry budou analyzovány pomocí přístupu pro bakterie a přístupu sekvenování vnitřní transkribované oblasti spaceru (High-throughput sekvenování).
5. Produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA) ve stolici a v séru: bude odebrán vzorek stolice a sérum. Zváží se jeden gram vzorků stolice, zředí se 1:2 sterilním fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a homogenizuje se. Supernatanty budou poté získány centrifugací (10 000 g, 30 minut, 4 °C), filtrovány přes 0,2 μm filtry a skladovány při -80 °C až do analýzy. Sérum pacientů se odebere pomocí zkumavek se separátorem séra a získá se centrifugací po dobu 10-15 minut. Sérum bude bleskově zmrazeno a skladováno při -80 °C až do další analýzy. Analýza SCFA bude provedena pomocí plynové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (MS) pro měření koncentrací kyseliny octové, propionové a máselné ve vzorcích stolice.
6. Sérová hladina interleukinu (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferonu (IFN)-γ: provedeme odběr žilní krve; sérum pacientů se odebere pomocí zkumavek se separátorem séra a získá se centrifugací po dobu 10-15 minut. Sérum bude bleskově zmrazeno a skladováno při -80 °C. Ze séra budou pomocí ELISA (specifická souprava pro každý cytokin) stanoveny IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ.
7. Stav methylace promotorové oblasti genů zapojených do alergie zprostředkované IgE, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 a IFN-γ a FoxP3+: Od pacientů bude odebrána venózní krev a bude odebrána DNA. extrahován z leukocytů pomocí DNA Extraction Kit. Extrahovaná DNA bude modifikována hydrogensiřičitanem sodným pomocí sady Methylation Gold Kit (ZYMO Research Co.) podle pokynů výrobce. Přeměněná DNA bude až do použití skladována při -70 °C. Methylační analýzy budou prováděny za použití High resolution melting Real Time (LightCycler® 480, Roche Applied Science). Výsledky budou potvrzeny přímým sekvenováním (modifikace Sangerovy metody: ddNTP značené čtyřmi různými fluorofory).