Approccio discendente nei bambini con allergia al latte vaccino (SDACMA)

60 bambini con APLV mediata da immunoglobulina E, osservati consecutivamente presso i Centri terziari per le allergie alimentari, che soddisferanno i criteri di inclusione saranno invitati a partecipare allo studio. Dati anamnestici, demografici, antropometrici e clinici, nonché informazioni su fattori socio-demografici, condizioni familiari e di vita, storia parentale di malattie allergiche, numero di fratelli e proprietari di animali domestici saranno ottenuti dai genitori di ciascun neonato e registrati in un banca dati clinica.

Quindi in tutti i soggetti verrà eseguito un test alimentare orale con EHCF + LGG. Solo i soggetti con test alimentare orale negativo verranno assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi di interventi dietetici per un periodo di follow-up di 12 mesi: il gruppo 1 ha ricevuto AAF e il gruppo 2 ha ricevuto EHCF + LGG.

L'uso efficace della formula sarà valutato durante lo studio da dietisti che consigliano i genitori sui problemi che potrebbero sorgere durante la dieta di eliminazione. Ai genitori o agli operatori sanitari verrà chiesto di tenere un registro giornaliero dell'uso della formula. La quantità preparata (millimetri di acqua e numero di cucchiai di latte artificiale) e quella che rimane dopo ogni consumo verranno registrate in un diario per valutare la quantità consumata dal bambino.

All'arruolamento, dopo 6 e 12 mesi la crescita corporea sarà valutata in base al peso corporeo, alla lunghezza del corpo e alla circonferenza cranica misurata all'arruolamento, dopo 6 e 12 mesi di follow-up con riferimento ai grafici di crescita. Se necessario, verranno effettuate visite non programmate.

Inoltre all'atto dell'arruolamento, dopo 6 e 12 mesi, gli sperimentatori eseguiranno:

1. Tutte le procedure di provocazione alimentare orale saranno eseguite in doppio cieco in 2 giorni consecutivi. Saranno disponibili attrezzature di emergenza complete e farmaci (epinefrina, antistaminici, steroidi). La sfida verrà interrotta alla comparsa dei sintomi clinici o al raggiungimento della dose massima. Il bambino verrà osservato per 2 ore e poi dimesso.
2. Skin prick test (latte intero, caseina, α-lattoalbumina, β-lattoglobulina): all'avambraccio volare del paziente verranno applicati allergeni e latte fresco: latte vaccino (CM) contenente il 3,5% di grassi. I prick test cutanei sono stati eseguiti utilizzando una lancetta a picco singolo da 1 mm (ALK, Copenhagen, Danimarca), con istamina dicloridrato (10 mg/ml) e soluzione salina isotonica (NaCl 0,9%) rispettivamente come controllo positivo e negativo. Le reazioni saranno registrate sulla base del diametro maggiore (in millimetri) del pomfo e della riacutizzazione a 15 min. Il risultato SPT sarà considerato "positivo" se il pomfo era di 3 mm o più grande, senza reazione del controllo negativo.
3. IgE totali e IgE specifiche e Immunoglobulina G 4 contro proteine ​​ed epitopi del latte vaccino: eseguiremo un prelievo di sangue venoso; il siero dei pazienti sarà raccolto utilizzando tubi separatori di siero in provetta ed è stato ottenuto mediante centrifugazione per 10-15 minuti. Il siero sarà congelato e conservato a -80 °C fino a ulteriori analisi. Dal siero, saranno analizzate con immunodosaggio enzimatico le IgE totali e IgE e IgG4 specifiche contro proteine ​​ed epitopi del latte vaccino.
4. Composizione del microbiota intestinale: un campione di feci verrà raccolto e immediatamente congelato a -80°C e conservato fino a ulteriori analisi. Il DNA genomico totale (gDNA) sarà isolato dal materiale fecale utilizzando un DNA specifico. Il kit di isolamento e la composizione del microbiota intestinale saranno analizzati utilizzando un approccio per i batteri e un approccio di sequenziamento della regione spaziatrice trascritta interna (sequenziamento ad alto rendimento).
5. Produzione fecale e sierica di acidi grassi a catena corta (SCFA): verranno raccolti un campione di feci e siero. Verrà pesato un grammo di campioni fecali, diluito 1:2 in soluzione salina sterile tamponata con fosfato e omogeneizzato. I surnatanti saranno quindi ottenuti mediante centrifugazione (10 000g, 30 minuti, 4°C), filtrati attraverso filtri da 0.2 μm e conservati a -80°C fino all'analisi. Il siero dei pazienti sarà raccolto utilizzando tubi separatori di siero in provetta ed è stato ottenuto mediante centrifugazione per 10-15 minuti. Il siero sarà congelato e conservato a -80 °C fino a ulteriori analisi. L'analisi degli SCFA sarà eseguita mediante gascromatografia-spettrometria di massa (MS) per misurare le concentrazioni di acido acetico, propionico e butirrico nei campioni fecali.
6. Livello sierico di interleuchina (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferone (IFN)-γ: eseguiremo un prelievo di sangue venoso; il siero dei pazienti sarà raccolto utilizzando tubi separatori di siero in provetta ed è stato ottenuto mediante centrifugazione per 10-15 minuti. Il siero sarà congelato rapidamente e conservato a -80 °C. Dal siero, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ saranno determinati mediante ELISA (kit specifico per ogni citochina).
7. Stato di metilazione della regione del promotore dei geni coinvolti nell'allergia IgE-mediata, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e IFN-γ e di FoxP3+: Il sangue venoso sarà prelevato dai pazienti e il DNA sarà estratto dai leucociti utilizzando il kit di estrazione del DNA. Il DNA estratto sarà modificato con bisolfito di sodio utilizzando il Methylation Gold Kit (ZYMO Research Co.) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA convertito verrà conservato a -70°C fino al momento dell'utilizzo. Le analisi di metilazione saranno eseguite utilizzando High resolution melting Real Time (LightCycler® 480, Roche Applied Science). I risultati saranno confermati mediante sequenziamento diretto (metodo Sanger modificato: ddNTP marcati con quattro diversi fluorofori).