Пошаговый подход к детям с аллергией на коровье молоко (SDACMA)

60 детей с CMA, опосредованной иммуноглобулином E, последовательно наблюдаемых в третичных центрах пищевой аллергии, которые будут соответствовать критериям включения, будут приглашены для участия в исследовании. Анамнестические, демографические, антропометрические и клинические данные, а также информация о социально-демографических факторах, семейных и жилищных условиях, родительском анамнезе аллергических заболеваний, количестве братьев и сестер и наличии домашних животных будут получены от родителей каждого младенца и записаны в клиническая база данных.

Затем всем субъектам будет проведена оральная пищевая проба с EHCF + LGG. Только субъекты с отрицательной пероральной пищевой пробой будут случайным образом распределены в одну из двух групп диетических вмешательств на период наблюдения 12 месяцев: группа 1 получала AAF, а группа 2 получала EHCF + LGG.

Эффективность использования формулы будет оцениваться во время исследования диетологами, консультирующими родителей по вопросам, которые могут возникнуть во время элиминационной диеты. Родителей или опекунов попросят вести ежедневный учет использования смеси. Приготовленное количество (миллиметры воды и количество ложек смеси) и количество, оставшееся после каждого потребления, будет записываться в дневник для оценки количества, выпитого ребенком.

При зачислении через 6 и 12 месяцев рост тела будет оцениваться по массе тела, длине тела и окружности головы, измеренным при зачислении, через 6 и 12 месяцев наблюдения со ссылкой на диаграммы роста. При необходимости будут совершаться внеплановые визиты.

Кроме того, при поступлении через 6 и 12 месяцев исследователи выполнят:

1. Все процедуры пероральной пищевой провокации будут проводиться двойным слепым методом в течение 2 дней подряд. Полный комплект неотложной помощи и лекарства (эпинефрин, антигистаминные препараты, стероиды) будут под рукой. Заражение будет остановлено при появлении клинических симптомов или при достижении максимальной дозы. Ребенок будет наблюдаться в течение 2 часов, а затем выписан.
2. Кожный прик-тест (цельное молоко, казеин, α-лактальбумин, β-лактоглобулин): аллергены и свежее молоко наносят на ладонные поверхности предплечья пациента: коровье молоко (КМ) с содержанием жира 3,5%. Кожные прик-тесты проводили с использованием ланцета с одним пиком длиной 1 мм (ALK, Копенгаген, Дания) с дигидрохлоридом гистамина (10 мг/мл) и изотоническим солевым раствором (0,9%) в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Реакции будут регистрироваться на основе наибольшего диаметра (в миллиметрах) волдыря и волдыря через 15 мин. Результат КПТ будет считаться «положительным», если волдырь был 3 мм или больше, без реакции отрицательного контроля.
3. Общий IgE и специфический IgE и Иммуноглобулин G 4 к белкам и эпитопам коровьего молока: сделаем забор венозной крови; сыворотку пациентов собирали с помощью пробирок-сепараторов сыворотки и получали центрифугированием в течение 10-15 минут. Сыворотку подвергают мгновенной заморозке и хранят при температуре -80 °C до дальнейшего анализа. Из сыворотки с помощью иммуноферментного анализа анализируют общий IgE и специфические IgE и IgG4 против белков и эпитопов коровьего молока.
4. Состав кишечной микробиоты: образец стула будет собран и немедленно заморожен до -80 ° C и сохранен до дальнейшего анализа. Полная геномная ДНК (гДНК) будет выделена из фекального материала с использованием специфической ДНК. Набор для изоляции и состав кишечной микробиоты будут проанализированы с использованием подхода к бактериям и подхода к секвенированию внутренней транскрибируемой спейсерной области (высокопроизводительное секвенирование).
5. Производство короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) в фекалиях и сыворотке: будут взяты образцы стула и сыворотки. Один грамм образцов фекалий взвешивают, разбавляют 1:2 стерильным фосфатно-солевым буфером и гомогенизируют. Затем супернатанты получают центрифугированием (10 000g, 30 минут, 4°C), фильтруют через фильтры 0,2 мкм и хранят при -80°C до анализа. Сыворотку пациентов собирают с помощью пробирок-сепараторов сыворотки и получают центрифугированием в течение 10-15 минут. Сыворотку подвергают мгновенной заморозке и хранят при температуре -80 °C до дальнейшего анализа. Анализ SCFAs будет проводиться с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии (МС) для измерения концентрации уксусной, пропионовой и масляной кислот в образцах фекалий.
6. Уровень интерлейкина (ИЛ)-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-10, интерферона (ИФН)-γ в сыворотке крови: сделаем анализ венозной крови; сыворотку пациентов собирали с помощью пробирок-сепараторов сыворотки и получали центрифугированием в течение 10-15 минут. Сыворотку подвергают мгновенной заморозке и хранят при температуре -80 °C. В сыворотке IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ будут определять с помощью ELISA (специфический набор для каждого цитокина).
7. Статус метилирования промоторной области генов, участвующих в IgE-опосредованной аллергии, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 и IFN-γ, а также FoxP3+: у пациентов будет получена венозная кровь, и ДНК будет выделены из лейкоцитов с помощью набора для выделения ДНК. Экстрагированная ДНК будет модифицирована бисульфитом натрия с использованием набора для метилирования золота (ZYMO Research Co.) в соответствии с инструкциями производителя. Преобразованная ДНК будет храниться при -70°C до использования. Анализы метилирования будут выполняться с использованием плавления высокого разрешения в реальном времени (LightCycler® 480, Roche Applied Science). Результаты будут подтверждены прямым секвенированием (модифицированный метод Сэнгера: ddNTPs, меченные четырьмя различными флуорофорами).