Enfoque de reducción en niños con alergia a la leche de vaca (SDACMA)

Se invitará a participar en el estudio a 60 niños con APLV mediada por inmunoglobulina E, observados consecutivamente en Centros de Alergia Alimentaria terciarios, que cumplan con los criterios de inclusión. Los datos anamnésticos, demográficos, antropométricos y clínicos, así como información sobre factores sociodemográficos, condiciones familiares y de vida, antecedentes de enfermedades alérgicas de los padres, número de hermanos y tenencia de mascotas se obtendrán de los padres de cada bebé y se registrarán en un base de datos clinica.

Luego en todos los sujetos se realizará una provocación alimentaria oral con EHCF + LGG. Solo los sujetos con provocación alimentaria oral negativa se asignarán aleatoriamente a uno de los dos grupos de intervenciones dietéticas durante un período de seguimiento de 12 meses: el grupo 1 recibió AAF y el grupo 2 recibió EHCF + LGG.

El uso efectivo de la fórmula será evaluado durante el estudio por dietistas que asesorarán a los padres sobre los problemas que podrían surgir durante la dieta de eliminación. Se les pedirá a los padres o cuidadores que lleven un registro diario del uso de la fórmula. La cantidad preparada (milímetros de agua y número de cucharas de fórmula) y la cantidad que queda después de cada consumo se registrará en un diario para evaluar la cantidad consumida por el niño.

En el momento de la inscripción, después de 6 y 12 meses, el crecimiento corporal se evaluará mediante el peso corporal, la longitud corporal y el perímetro cefálico medidos en el momento de la inscripción, después de 6 y 12 meses de seguimiento con referencia a las tablas de crecimiento. Se realizarán visitas no programadas si es necesario.

Además en el momento de la inscripción, después de 6 y 12 meses, los investigadores realizarán:

1. Todos los procedimientos de provocación alimentaria oral se realizarán a doble ciego en 2 días consecutivos. Se dispondrá de equipo completo de emergencia y medicamentos (epinefrina, antihistamínicos, esteroides). La provocación se detendrá ante la aparición de síntomas clínicos o cuando se alcance la dosis máxima. Se observará al niño durante 2 horas y luego se le dará de alta.
2. Prueba cutánea (leche entera, caseína, α-lactoalbúmina, β-lactoglobulina): se aplicarán alérgenos y leche fresca al antebrazo del paciente: leche de vaca (CM) con un contenido de grasa del 3,5 %. Las pruebas cutáneas se realizaron con una lanceta de pico único de 1 mm (ALK, Copenhague, Dinamarca), con diclorhidrato de histamina (10 mg/ml) y solución salina isotónica (NaCl 0,9%) como control positivo y negativo, respectivamente. Las reacciones se registrarán sobre la base del diámetro más grande (en milímetros) de la roncha y el ensanchamiento a los 15 min. El resultado de SPT se considerará "positivo" si la roncha fue de 3 mm o más, sin reacción del control negativo.
3. IgE total e IgE específica e Inmunoglobulina G 4 frente a proteínas y epítopos de la leche de vaca: realizaremos una muestra de sangre venosa; El suero de los pacientes se recogerá utilizando tubos separadores de suero y se obtuvo mediante centrifugación durante 10-15 minutos. El suero se congelará rápidamente y se almacenará a -80 °C hasta su posterior análisis. A partir del suero se analizará con inmunoensayo enzimático la IgE total y la IgE e IgG4 específicas frente a proteínas y epítopos de la leche de vaca.
4. Composición de la microbiota intestinal: se recogerá una muestra de heces y se congelará inmediatamente a -80 °C y se almacenará hasta su posterior análisis. El ADN genómico total (ADNg) se aislará de la materia fecal utilizando un ADN específico. El kit de aislamiento y la composición de la microbiota intestinal se analizarán utilizando un enfoque para bacterias y un enfoque de secuenciación de la región espaciadora transcrita interna (secuenciación de alto rendimiento).
5. Producción de suero y heces de ácidos grasos de cadena corta (AGCC): se recolectará una muestra de heces y suero. Se pesará un gramo de muestras fecales, se diluirá 1:2 en solución salina tamponada con fosfato estéril y se homogeneizará. A continuación, los sobrenadantes se obtendrán por centrifugación (10 000 g, 30 minutos, 4 °C), se filtrarán a través de filtros de 0,2 μm y se almacenarán a -80 °C hasta su análisis. El suero de los pacientes se recogerá utilizando tubos separadores de suero y se obtuvo mediante centrifugación durante 10-15 minutos. El suero se congelará rápidamente y se almacenará a -80 °C hasta su posterior análisis. El análisis de SCFA se realizará mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (MS) para medir las concentraciones de ácido acético, propiónico y butírico en muestras fecales.
6. Nivel sérico de interleucina (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferón (IFN)-γ: realizaremos una muestra de sangre venosa; El suero de los pacientes se recogerá utilizando tubos separadores de suero y se obtuvo mediante centrifugación durante 10-15 minutos. El suero se congelará rápidamente y se almacenará a -80 °C. Del suero se determinará IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ por ELISA (kit específico para cada citocina).
7. Estado de metilación de la región promotora de genes implicados en alergia mediada por IgE, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e IFN-γ y de FoxP3+: Se obtendrá sangre venosa de los pacientes y se analizará ADN extraído de leucocitos utilizando el kit de extracción de ADN. El ADN extraído se modificará con bisulfito de sodio utilizando el kit de oro de metilación (ZYMO Research Co.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN convertido se almacenará a -70 °C hasta su uso. Los análisis de metilación se realizarán utilizando fusión de alta resolución en tiempo real (LightCycler® 480, Roche Applied Science). Los resultados se confirmarán mediante secuenciación directa (método de Sanger modificado: ddNTP marcados con cuatro fluoróforos diferentes).