Stapsgewijze benadering bij kinderen met koemelkallergie (SDACMA)

60 Immunoglobuline E-gemedieerde CMA-kinderen, achtereenvolgens geobserveerd in tertiaire centra voor voedselallergie, die zullen voldoen aan de inclusiecriteria, zullen worden uitgenodigd om deel te nemen aan het onderzoek. Anamnestische, demografische, antropometrische en klinische gegevens, evenals informatie over sociaal-demografische factoren, gezins- en levensomstandigheden, ouderlijke geschiedenis van allergische ziekten, aantal broers en zussen en het bezit van huisdieren zullen worden verkregen van de ouders van elk kind en worden vastgelegd in een klinische databank.

Vervolgens wordt bij alle proefpersonen een orale voedselprovocatie met EHCF + LGG uitgevoerd. Alleen proefpersonen met een negatieve orale voedselprovocatie worden willekeurig toegewezen aan een van de twee groepen dieetinterventies gedurende een follow-upperiode van 12 maanden: groep 1 kreeg AAF en groep 2 kreeg EHCF + LGG.

Effectief gebruik van de formule zal tijdens het onderzoek worden geëvalueerd door diëtisten die ouders adviseren over problemen die zich kunnen voordoen tijdens het eliminatiedieet. Ouders of verzorgers wordt gevraagd om dagelijks het gebruik van formules bij te houden. De bereide hoeveelheid (millimeter water en aantal formule-lepels) en de resterende hoeveelheid na elke consumptie worden in een dagboek bijgehouden om de door het kind geconsumeerde hoeveelheid te beoordelen.

Bij inschrijving wordt de lichaamsgroei na 6 en 12 maanden beoordeeld aan de hand van lichaamsgewicht, lichaamslengte en hoofdomtrek gemeten bij inschrijving, na 6 en 12 maanden follow-up met verwijzing naar groeigrafieken. Indien nodig worden ongeplande bezoeken afgelegd.

Daarnaast voeren de onderzoekers bij inschrijving, na 6 en 12 maanden:

1. Alle orale voedselprovocatieprocedures zullen op 2 opeenvolgende dagen dubbelblind worden uitgevoerd. Volledige nooduitrusting en medicijnen (epinefrine, antihistaminica, steroïden) zijn aanwezig. De provocatie zal worden stopgezet bij het optreden van klinische symptomen of wanneer de hoogste dosis is bereikt. Het kind wordt 2 uur geobserveerd en daarna ontslagen.
2. Huidpriktest (volle melk, caseïne, α-lactalbumine, β-lactoglobuline): allergenen en verse melk worden aangebracht op de onderarm van de patiënt: koemelk (CM) met 3,5% vet. Huidpriktesten werden uitgevoerd met behulp van een lancet met enkele piek van 1 mm (ALK, Kopenhagen, Denemarken), met respectievelijk histaminedihydrochloride (10 mg/ml) en isotone zoutoplossing (NaCl 0,9%) als positieve en negatieve controle. Reacties worden geregistreerd op basis van de grootste diameter (in millimeters) van de wheal en flare op 15 min. Het SPT-resultaat wordt als "positief" beschouwd als de kwaddel 3 mm of groter was, zonder reactie van de negatieve controle.
3. Totaal IgE en specifiek IgE en Immunoglobuline G 4 tegen eiwitten en epitopen van koemelk: we zullen een veneus bloedmonster nemen; serum van de patiënten zal worden verzameld met behulp van buisserumscheidingsbuizen en werd verkregen door gedurende 10-15 minuten te centrifugeren. Serum wordt snel ingevroren en bewaard bij -80 °C tot verdere analyse. Van serum zal totaal IgE en specifiek IgE en IgG4 tegen eiwitten en epitopen van koemelk geanalyseerd worden met enzymatische immunoassay.
4. Samenstelling van de darmflora: er wordt een ontlastingsmonster genomen en onmiddellijk ingevroren tot -80°C en bewaard tot verdere analyse. Totaal genomisch DNA (gDNA) zal worden geïsoleerd uit fecaal materiaal met behulp van een specifiek DNA. De samenstelling van de isolatiekit en de samenstelling van de darmmicrobiota zal worden geanalyseerd met behulp van een benadering voor bacteriën en een interne getranscribeerde spacerregio-sequencingbenadering (High-throughput sequencing).
5. Korte keten vetzuren (SCFA's) fecale en serumproductie: een ontlastingsmonster en serum worden verzameld. Eén gram fecale monsters wordt gewogen, 1:2 verdund in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing en gehomogeniseerd. Supernatanten worden vervolgens verkregen door centrifugeren (10.000 g, 30 minuten, 4°C), gefiltreerd door 0,2-μm filters en bewaard bij -80°C tot analyse. Serum van de patiënten zal worden verzameld met behulp van buisserumscheidingsbuizen en werd verkregen door gedurende 10-15 minuten te centrifugeren. Serum wordt snel ingevroren en bewaard bij -80 °C tot verdere analyse. Analyse van SCFA's zal worden uitgevoerd met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (MS) om de concentraties van azijnzuur, propionzuur en boterzuur in fecale monsters te meten.
6. Serumgehalte van interleukine (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-10, interferon (IFN)-γ: we zullen een veneus bloedmonster nemen; serum van de patiënten zal worden verzameld met behulp van buisserumscheidingsbuizen en werd verkregen door gedurende 10-15 minuten te centrifugeren. Serum wordt snel ingevroren en bewaard bij -80 °C. Van serum zullen IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, IFN-γ worden bepaald door ELISA (specifieke kit voor elk cytokine).
7. Methyleringsstatus van het promotorgebied van genen die betrokken zijn bij IgE-gemedieerde allergie, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 en IFN-γ en van FoxP3+: Veneus bloed zal worden verkregen van de patiënten en DNA zal worden verkregen geëxtraheerd uit leukocyten met behulp van de DNA-extractiekit. Geëxtraheerd DNA wordt gemodificeerd met natriumbisulfiet met behulp van de Methylation Gold Kit (ZYMO Research Co.) volgens de instructies van de fabrikant. Het geconverteerde DNA wordt tot gebruik bij -70°C bewaard. Methyleringsanalyses zullen worden uitgevoerd met behulp van Real Time smelten met hoge resolutie (LightCycler® 480, Roche Applied Science). De resultaten zullen worden bevestigd door directe sequencing (aangepaste Sanger-methode: ddNTP's gelabeld met vier verschillende fluoroforen).